组培应用之茎尖脱毒

组培应用之茎尖脱毒

1、理论依据

植物细胞全能性学说1943年white提出了“植物细胞全能性”学说。1958年，steward和reinert对这一学说进行了验证，即一切植物都是由细胞构成的，植物的幼龄细胞含有全套遗传基因，具有形成完整植株的能力。

植物病毒在寄主体内分布不均匀怀特和利马塞特.科钮特发现，植物根尖和茎尖部分病毒含量极低或不能发现病毒。植物组织内的病毒含量随与茎尖相隔距离加大而增加。究其原因可能有四个方面：其一，一般病毒顺着植物的微管系统移动，而分生组织中无此系统；病毒通过胞间连丝移动极慢，难以追上茎尖分生组织的活跃生长；其二，活跃生长的茎尖分生组织代谢水平很高，致使病毒无法复制；其三，植物体内可能存在“病毒钝化系统”，而在茎尖分生组织内活性应最高，钝化病毒，使茎尖分生组织不受病毒侵染；其四，茎尖分生组织的生长素含量很高，足以抑制病毒增殖。

2、脱毒方法

培育脱毒母株，获得外植体

a.正确选择品种。用于生产的品种选择很重要。因不同品种产量、品质特性及对病毒侵染的反应不同，关系到去病毒的增产效果和脱毒种苗的应用年限。因此，要选择品质好，产量高，抗、耐病毒病性好的品种。

b.确保品种纯度。确保获取快繁外植体母株的品种纯度是生产高纯度、优质种苗的基础。特别是栽培历史长的无性繁殖作物，用种量大、易造成品种混杂。因此严格鉴定获取快繁外植体母株的品种纯度，可避免无效劳动，提高工作效率。

c.获得外植体。外植体可直接取于大田，但最好取于室内培育的，选择生长健壮、无病虫害的母株，既不受季节影响，又易消毒。

选择培养基。研究确定的基本培养基有许多种，其中ms适合于大多数双子叶植物，培养基b5和培养基n6适合于许多单子叶植物，white培养基适于根的培养，应先试用这些培养基再根据实际情况对其中的某些成分做小范围调整。一般培养用ms培养基均能成功，但大蒜、洋葱用b5和n6培养基较好。

激素浓度和相对比例的确定。用不同种类的激素进行浓度和比例的配合试验。在比较好组合基础上进行小范围的调整，设计出新的配方，经过反复摸索，选出一种适合培养基。

剥离和接种将处理好的植物部分，如包含茎尖的茎段或芽等灭菌，置超净工作台40倍显微镜下，剥去外叶和较大的叶原基，暴露出生长点分生组织，剥离带1~2个叶原基的分生组织，接种到试管内的芽分化培养基上。

继代培养生根和快繁将已接种外植体的试管置℃，光照3000lx，在光周期13-16h/d的培养基中培养2-3周成苗。待苗长至1-2cm高，转入生根培养基，生长7-10d生根，转入快繁培养基继续繁殖。

3、茎尖培养的关键技术环节

要提高茎尖培养成苗率和脱毒必须掌握下列关键环节

剥取适当大小的茎尖通常培养茎尖越小，产生幼苗的无毒率越高，而成活率越低。不同病毒种类去除的难易程度不同。因此需针对不同的病毒种类，培养适宜大小的茎尖。例如剥离培养带一个叶原基的生长点产生的马铃薯植株，可去处全部马铃薯卷叶病毒，去除80%y病毒和a病毒，去除0.2%x病毒。马铃薯病毒去除从易到难的顺序是：马铃薯卷叶病毒、马铃薯a病毒、马铃薯y病毒、奥古巴病毒、马铃薯m病毒、马铃薯x病毒、马铃薯s病毒和纺锤块茎类病毒。对于同一种病毒，剥离茎尖越小，脱毒率越高。大蒜带1个叶原基的茎尖产生苗中84%检测不到病毒，而带2-3个叶原基的无毒株率仅59%。因此，一般剥离带1-2个叶原基的茎尖即可获得较好的脱毒效果。对于难脱除的病毒则应配合采用其他措施。

选用正确的培养基培养基由大量元素、微量元素、有机成分、植物激素、糖和琼脂调配而成。一般铵盐及钾盐浓度高，有利于茎尖成活，反之则有利于生根或根生长，植物激素对茎尖的生长和发育有重要作用。植物细胞分裂素类如6-ba有利于长芽，而生长素类naa有利于生根。不同品种对激素的反应不同。

适宜的环境条件大蒜、马铃薯、草莓接种后置温度23-25℃，光照1000-3000lx，每日照光13-16h。甘薯茎尖培养需温度较高，约26-32℃，光强和照光时间同马铃薯和大蒜。

茎尖接种后的生长及调节方法茎尖接种后的生长情况主要有4种。1）生长正常，生长点伸长，基本无愈伤组织形成，1-3周内形成小芽，4-6周长成小植株。2）生长停止，接种物不扩大，渐变褐色，至枯死。此情况多因剥离操作过程中茎尖受伤。3）生长缓慢，接种物扩大缓慢，渐转绿，成一绿点。说明培养条件不适应，要迅速转入高激素浓度培养基，并适当提高培养温度。4）生长过速，生长点不伸长或略伸长，大量疏松愈伤组织形成，需转入无激素培养基或采取降低培养温度等措施。