一种植物表达载体的构建及其金柑上的瞬时表达

一种植物表达载体的构建及其金柑上的瞬时表达

摘要：以植物表达载体pCambial301的带内含子的GUS(iGUS)基因替换植物表达载体pBI121中的GUS基因，构建了以pBI121为基础载体并含有iGUS的植物表达载体pLZ13。农杆菌染色表明，pCamiba1301和pLZ13两载体中的iGUS基因均不会导致GUS染色反应。以金柑不同组织为材料，通过农杆菌介导开展瞬时表达研究，结果表明，pLZ13和pCambial301两载体的iGUS在CaMV 35S启动子调控下的表达没有差异，证明构建的pLZ13是一种同时适于瞬时表达和转基因研究的植物表达载体。

关键词：金柑；iGUS；瞬时表达；启动子；转基因；植物表达载体

中图分类号：S666.9 文献标识码：A

文章编号：1009-9980(2008)03-431-04

基因工程技术是植物遗传改良的重要手段之一，植物组织或发育阶段特异启动子的筛选和鉴定是植物基因工程研究的重要内容。在启动子下游融合一个报告基因，依据报告基因在不同时空或者处理后的表达可研究启动子的功能。在这些研究中，稳定遗传转化(转基因)和瞬时表达手段常被使用。

由于瞬时表达手段快速且简单，且不受遗传转化难易的影响，广泛应用于特异启动子的初步筛选和鉴定，特别是果实特异启动子的研究。内含子作为真核与原核生物功能基因的重要差异，在真核生物mRNA成熟过程中可被精确地切除，而在原核细胞中则不会，故带内含子的GUS基因(iGUS)更适于瞬时表达研究。

pBI121和pCambia1301是最常用的植物表达载体之一。不少转基因研究所用的表达载体以其为骨架改造而成。pBll21含有GUS基因，不适于瞬时表达研究；而pCambial301因为采用潮霉素筛选体系而在柑橘转基因研究中极少应用。转基因和瞬时表达手段是鉴定启动子特性的2种有效手段，结合使用最有说服力。基于pBI121和pCambia1301的植物表达载体的各自优缺点，对于每个待研究的启动子，需要分别构建基于pBI121和pCambia1301的植物表达载体，这不但增大了工作量，且由于应用了不同载体不利于结果的相互印证。另外，pCambia1301载体的启动子两侧缺乏常用内切酶位点，对更换启动子带来很大不便。因此，作者旨在从载体pCam—bial301中酶切获得iGUS基因，然后替换pBI121中的GUS基因。获得一个既适于转基因也可用于瞬时表达研究的植物表达载体并进行表达验证。

1　材料和方法

1．1　材料

以金柑(Fortunella crassifolia Swingle)组培苗的根、茎、叶，金柑成年树的花瓣、子房、果实为实验试材。根癌农杆菌(Agrobacterium tttmefaciens)菌株GV3101，植物表达载体pBI121和pCmabia1301质粒均为本实验室保存。试验所用的限制性内切酶BstEⅡ，Nco Ⅰ，Not Ⅰ，Sac Ⅰ，Xba Ⅰ购自上海生工生物工程技术服务有限公司。

1．2　方法

2．2　含不同表达载体的农杆菌GUS染色结果

含不同表达载体的农杆菌菌液经GUS组织化学染色。不含表达载体以及含有pLZ13或pCamibial301(均携带iGUS基因)的农杆菌GV3101染色结果均显示无色，而包含pBll21(携带无内含子的GUS基因)的农杆菌被染成蓝色(图版－a～d)。

2．3　农杆菌介导的瞬时表达GUS染色结果

分别以含有pLZl3及pCambia1301表达载体的农杆菌转化金柑不同组织器官做瞬时表达研究(图版-A1～F2)。2个载体中的具内含子GUS基因在组成型CaMV 35S启动子调控下，在金柑各个组织中均表达。其中根、花瓣、果实组织有明显蓝色斑块或斑点，茎段在横切面上蓝色较为明显。叶片和子房中蓝色斑点较少且较淡。表明pLZ13载体中的iGUS基因与pCambia1301中的该基因功能相同，因而pLZl3适于瞬时表达研究。

3　讨论

启动子作为转录水平上一种重要的调控元件，在基因表达调控中起着重要作用。近年来，研究特异启动子功能及其调控因素已成为基因工程技术的重要内容。不含内含子的GUS基因在农杆菌中可以正常表达，因此，在瞬时表达研究中可造成严重干扰，影响表达强度的准确检测。如GUS染色结果表明。pBI121载体中不含内含子的GUS基因在农杆菌中可以得到表达。因此，若将pBI121载体用于瞬时表达。将难以区分染色结果是由于农杆菌污染造成还是GUS基因在植物组织中的瞬时表达所致。同时，在稳定表达的转基因研究中，在初期检测时由于存在农杆菌污染也使检测受到干扰。

为避免这一干扰，采用iGUS基因作为瞬时表达载体的报告基因已逐渐成为趋势。由于原核细胞在基因转录过程中没有剪接内含子的能力，因而含有内含子的基因只能在真核细胞中进行表达而不能在原核细胞中表达。对pCambia1301和pLZ13(均含有iGUS基因)转化的农杆菌进行GUS染色所得的结果也证实这一策略的可行性(图3)。

pBI121和pCambia1301是最常用的2种植物表达载体之一，但前者不适于瞬时表达(GUS基因在农杆菌中可表达)而后者不适于柑橘转基因(采用潮霉素筛选，柑橘上此筛选体系尚不成熟)。因此，本研究用pCambia1301中的iGUS基因替代pBI121中的GUS基因，获得了一个兼具pCambia1301含农杆菌中不表达的iGUS以及pBOI121具有常用酶切位点及卡那抗性基因优点的植物表达载体pLZ13。该载体是一种既适于瞬时表达也可用于转基因研究的植物表达载体。在后续研究中，我们分离了番茄果实特异启动子2A11，并用其代替了pLZ13表达载体中的CaMV 35S启动子，应用本文建立的瞬时表达体系和先前建立的转基因体系对2A11启动子在金柑中的表达特性进行了探讨。

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