甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体的构建及其转化烟草的研究

摘　要：用限制性内切酶从目的基因供体质粒pBI－aPG上切下大小约2.3 kb的目的基因，将它定向连接在受体质粒pCAMBIA2301载体上，构建成含有GUS基因和NPTⅡ基因的甜瓜多聚半乳糖醛酸酶反义基因植物表达载体pCB－aPG。采用直接转化法将pCB－aPG导人根癌农杆菌菌株LBA4404，采用该菌株对普通烟草进行了遗传转化研究。在Kanamycin选择压力下获得的烟草转化不定芽和完整植株，经过GUS基因组织化学法检测以及PCR方法鉴定，证实了该反义基因已导人烟草基因组中。此项研究为下一阶段用该反义基因转化甜瓜品种以改良甜瓜果实耐贮运性打下基础。

关键词：甜瓜；PG；反义基因；植物表达载体

中图分类号：S652　文献标识码：A　文章编号：1009-9980(2007)04-492-04

在全世界大宗水果的排名中，甜瓜居于第九位，是全世界普遍栽培的、经济价值很高的重要园艺作物。然而大多数甜瓜属于呼吸跃变型果实，达到生理成熟的甜瓜果实采收后会很快出现呼吸高峰，果肉迅速变软，商品性和贮运性大大降低。据统计，*哈密瓜在销售地的短期贮藏损失达15％，甘肃黄河密甜瓜运销过程中的损耗高达29.3％。这给种植者和经营者都带来了重大的经济损失。也在一定程度上影响了甜瓜产业的发展。

甜瓜果实的成熟软化与果胶的降解有重要的关系。多聚半乳糖醛酸酶(Polygalacturonase，PG)是一种细胞壁结合蛋白，可以催化果胶分子中a-1，4-聚半乳糖醛酸的裂解，参与果胶的降解，使细胞壁结构解体，导致果实软化。构建PG反义基因植物表达载体，通过基因工程手段导入植物体内，可以大幅度降低PG含量，在一定程度上缓解果实软化．达到耐贮运的目的。在番茄上已有报道，并具有良好的商业化前景。在甜瓜中，未见类似报道。我们在前期研究工作中克隆到一个甜瓜PG基因，作者的目的就是构建其反义基因植物表达载体并转化模式植物烟草以验证该植物表达载体的可用性，以期为下一阶段转化甜瓜，改善其贮运性奠定一定的理论基础。

1　材料和方法

1．1　材料

质粒pBI-aPG、pCAMBIA2301、大肠杆菌菌株DH5ct和农杆菌LBA4404由本实验室保存。各种限制性内切酶、DNA marker购自上海生工公司；CIP、T4DNA连接酶购自Promege公司。

1．2　重组质粒的构建

用限制性内切酶EcoR I和HindⅢ从目的基因供体pBI-aPG上切下3端加有CaMV35S启动子和5′端加有NOS终止子的PG反义嵌合基因35Sp-aPG-NOSt(约2.3 kb)，将其插到相同酶切并进行磷酸化的线性pCAMBIA2301质粒载体上，从而构建成植物表达载体pCB-aPG(图1)。

1．3　重组质粒的筛选及鉴定

提取质粒DNA，进行电泳滞后带检测。从电泳产生滞后带的重组质粒中随机挑取重组质粒进行PCR鉴定。对PCR鉴定呈阳性的质粒进行双酶切鉴定，将构建好的该反义基因植物表达载体命名为pCB-aPG。

1．4　pCB-aPG转化烟草

采用直接转化法将pCB-aPG导入农杆菌LBA4404t81。提取质粒翻，进行PCR扩增鉴定。烟草的转化采取叶盘法，对经抗生素筛选且在生根培养基上长出的完整植株进行GUS活性检测，并对其进行分子鉴定。

2　结果与分析

2．1 DCB-aPG植物表达载体的构建

将回收的DBI-aPG小片段和载体pCAMBIA2301进行连接，并将连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态，取250 txL连接产物涂在附加有75 mg／LKana的LB琼脂平板上，37℃过夜培养后，平板上生长15个白色的单菌落。而对照(以ddH₂O替代连接产物转化大肠杆菌DH5a感受态)平板上没有长出菌落。

随机挑取处理平板上的单菌落进行电泳滞后带鉴定，用pCAMBIA2301质粒DNA做对照(图2)。结果表明，随机挑取的4个菌落的电泳带均比对照滞后。取滞后带质粒为模板，用特异性引物对其进行PCR鉴定，结果表明(图3)，重组质粒PCR可以获得约1200 bp的电泳条带，与预期带大小一样。随机挑取一个PCR阳性质粒进行EcoR I和HindⅢ双酶切．切下了大小约2.3 kb的预期片段。同时，对挑取的质粒进行Xba I和Sac I双酶切，也切下了预期大小为1.2 kh的片段(图4)。通过上述几种方法检测，证明目的片段已经整合进载体质粒中，命名重组质粒为pCB—aPG。

2．2　重组质粒pCB-aPG转化农杆菌

采用直接转化法，用重组质粒pCB-aPG转化感受态农杆菌LBA4404，在筛选培养基(YEP+Kan75 mg／L+Str 25 mg／L+Rif 25 mg／L)上获得了20个菌落，对照组(仅有农杆菌LBA4404)无菌落形成。这说明pCB-aPG已转入农杆菌LBA4404中。从长有转化农杆菌菌落的平板上各随机挑取2个分隔良好的单菌落提取质粒，用克隆PG基因特异引物进行PCR扩增，结果都扩增出了1.2 kb的DNA分子片段(图5)，说明转化获得成功。

2．3　农杆菌转化烟草

经农杆菌浸染的烟草叶盘在选择分化培养基上进行诱导分化培养，处理的外植体在选择培养基上大都能诱导出不定芽丛，而对照外植体则表现黄化．无不定芽产生，停止生长。将不定芽转入到附加Kan 100 mg／L的生根培养基上生长4周后，假阳性芽逐渐自下而上褪绿死亡，转化芽则分化生根，正常生长。将完整植株进行GUS的组织化学法鉴定，得到了染色反应(图版-2～4)。提取具有GUS活性的完整植株DNA，用特异引物进行PCR扩增。电泳结果显示扩增得到预期大小的特异性片断(1.2 kb)，并与阳性对照具有一致的PCR特异性扩增条带，而作为阴性对照的未转基因烟草叶片总DNA的PCR没有特异性扩增条带(图6)。证明烟草转化成功。

3　讨论

甜瓜果实硬度是果实品质构成要素之一，与采后贮藏运输特性有密切关系，保持甜瓜果实硬度是提高甜瓜货架期的有效途径之一。科学研究发现PG在果实软化过程中起了重要作用。通过反义基因技术，一方面，可以有效地降低植物体内PG含量，在一定程度上抑制果实软化，提高果实货架期：另一方面，由于PG活性被很大程度地抑制，果胶降解减慢，较好地维持了果实细胞壁结构，使病源微生物不易侵入果实，从而增强抗病性。同时，果实更耐机械损伤，抗裂果。因而，我们拟通过遗传转化手段，将PG反义基因导入甜瓜，培育耐贮运的甜瓜品种，具有重要的意义。

我们在前期工作中，构建了1个植物表达载体pBI-aPG，在甜瓜遗传转化研究中发挥了重要的作用。但是这个植物表达载体的构建是去除了质粒载体pBll21中的gus基因，代之以PG基因而得的。去除了gus基因，一方面质粒相对较小，容易转化；但另一方面，由于去除了报告基因，在后续遗传转化工作中不能用简便，快捷，灵敏的GUS组织化学法进行检测，给研究工作带了极大的不便。所以有必要对pBI-aPG进行改造，重新添加上GUS报告基因。

构建好植物表达载体pCB-aPG后，我们首先转化模式植物烟草，检测载体构建是否正确。在烟草转化过程中，通过抗生素Kan筛选、GUS组织化学法和PCR检测，我们分别鉴定了NPTⅡ选择基因、gus报告基因和PG目的基因，也证明了植物表达载体pCB-aPG构建正确，并具有可用性。此研究为进一步开展甜瓜果实耐贮运性基因改良打下了基础。

4　结论

从供体质粒pBI-aPG上切下目的基因，将其连接到受体质粒pCAMBIA2301上，通过抗生素筛选、滞后带、PCR、及双酶切鉴定，证明成功构建了甜瓜PG反义基因植物表达载体pCB-aPG。用直接法将其转入农杆菌菌株LBA4404，组成工程菌pCB－aPG／At．LBA4404。用所构建的工程菌转化烟草，通过抗生素选择、GUS活性鉴定以及PCR分子检测证明获得转基因烟草，同时也证明所构建的植物表达载体oCB-aPG的目的基因、报告基因及选择标记基因完好，并且能够正确表达，为下一步的甜瓜作物的遗传转化工作奠定了基础。【柑橘及其近缘属植物ＬＦＹ同源基因的比较】