桉树组培技术详细说明

桉树组培技术详细说明

 组织培养指以分离出植物各部分的组织，如分生组织、形成层、木质部、韧皮部、表皮、皮层、胚乳组织、髓部等或已诱导的愈伤组织为外植体的离体无菌培养。桉树组织培养研究始于60年代，据报道，有20多种桉树可通过植株的不同部分，种子、下胚轴、幼苗的根、茎段、叶柄、叶片、茎尖、结节、花药、树皮外植体和花粉粒等。通过组织培养形成愈伤组织，目前，桉树组织培养发展很快，已解决了连续培养小植株的器官发生，试管苗的移栽和移栽后生长等一系列关键技术问题。

 桉树组培获得成功，主要解决了一些难以生根的树种或无法采用扦插方法增繁无性系的繁殖问题，加快优良无性系化的繁殖速度，同时无性系组培苗可直接上山造林，但组培技术操作要求严格，采用无菌操作，且成本较高，对大面积造林来说不利于产出的经济效益，因此目前生产单位通常使用组培方法培育扦插母株作为扦插扩大材料，然后通过扦插繁殖生产大量苗木营建速生丰产林与诸如嫁接苗芽条和萌芽条等相比，组培苗芽条的幼态化最佳，有分生机能的薄壁细胞活跃、再生能力比较强、扦插更容易生根成活。

 一实验室设备及其操作

 桉树组织培养是一项技术性很强的工作，无菌条件要求严格，对实验室设备及人员的操作技术要求较高，组培实验室应配备下列设备。

 第一洗涤设备、设置洗涤室、洗涤剂及各种洗涤工具

 第二灭菌设备、设置高压高温灭菌锅、烘箱等

 第三化学实验设备、设置实验台架、药品柜、冰箱、离心机、天平、各种、玻璃器皿、PH计、搅拌器、蒸馏器等

 第四无菌操作设备、设置无菌室、超净台、接种箱、超净室及接种工具、镊子、剪刀、解剖刀、接种铲及酒精灯等

 第五培养设备、设置培养箱室、培养容器、三角瓶、试管、罐头瓶等

 二培养基及其附加成分

 植物组织培养应用的培养基，一般都包括大量元素、微量元素和碳水化合物，并添加各种各样的附加物，如维生素、氨基酸、生长素、细胞分裂素等。

 桉树芽的诱导可选用White、B5H、N6、和MS等作基本培养基、胚状体的诱导可选用B5H及改良H等作基本培养基。

 三桉树组培技术

 桉树组织培养技术通常有两种方法一是取植株嫩茎段或不定芽接种培养形成愈伤组织分化长成完整植株二是取无菌种子或无茵发芽后的苗段诱导胚状体。

 生长成完整植株。

 1愈伤组织形成和分化

 1外植体的采集

 采集对象为嫁接苗或伐桩、环割、萌芽条、截取具有半木质化程度的嫩梢长度为5~10cm试验证明，3~5月份桉树萌芽率较高，茎部积累有较丰富的营养物质和内源激素，受病虫侵害较少、外植体诱导成功率最高，7~9月份属高温高湿季节，水分、温度都较高、病虫十分活跃、茎段机械损伤较多、易受病、虫菌的侵害污染，诱导成功率最低，因此外植体采集最好是在春季进行，以芽条腋芽开始膨大，芽鳞片还未裂开时为最佳时机，芽条在植株上的部位也是诱导芽能否成功的重要因素，试验证明，萌芽条中上部的茎段，第5~第7节最好，（中下部第8~第10节）茎段木质化程度较好。芽不易萌动、易褐化、梢部因芽组织幼嫩、消毒时易被杀伤、褐化严重，另外，枝条修剪萌发的枝条，且用抗菌素溶液和杀菌剂预处理后诱导效果也不错。

 2外植体消毒

 将采回的桉树嫩茎段剪去叶片，用自来水洗干净，在无菌条件下用70%酒精浸泡10秒钟，再用新洁尔灭溶液或0.1升汞溶液浸5~6分钟消毒，用无菌水冲洗4~5次，然后切取含1~2个腋芽的茎段接种在培养基上进行诱导培养，试验证明，重复消毒一次效果更佳。

 3褐变及其预防

 桉树茎段接种后，如切口处产生褐色渗出物，使茎段周围的培养基变成棕褐色，茎段在培养基内的基部变褐色就会失去生命力，导致外植体死亡、严重地影响了外植体诱导的成功率，可采取以下措施综合防治。尽量避免组织伤害，用于切割的解剖刀应尽可能锋利，切割外植体时，把组织浸于水中隔绝空气、切面要垂直、切口的损伤要减至最低的限度，接种时选择表面消毒过程中没有损伤的茎段，注意不让腋芽附着培养基，利用漫射光培养，由于光能提高多氧化酶的活性，从而促进多酚化合物的氧化，因此在弱光下培养，能有效地降低多酚氧化物的氧化。及时转移培养基，当发生褐变时应及时转移培养基，使褐化不影响腋芽周

 围的组织，外植体仍有萌动的生命力。

 4芽的诱导

 将含有腋芽的茎段接种在1/2MS+0.5mg/LBA+1mg/LIBA的培养基上，在26下进行诱导培养，经20~30天培养，可形成肉眼可见的愈伤组织，诱导率达95%以上，愈伤组织多发生在切口处、呈颗粒状、紧密、也可发生在非切口处、呈瘤状、疏松。

 5芽的增殖

 将愈伤组织转移到MS+0.5mg/LBA+0.25mg/LIBA的培养基上，在此条件下两种愈伤组织都可形成芽，但瘤状愈伤组织多产生丛生型芽，不能抽茎和展叶颗粒状愈伤组织形成单生型芽、芽多而密集、能抽茎和展叶。

 6生根苗的诱导

 当苗高2~3cm时，即可进行生根的诱导，一般一个500ml的三角瓶有400~600

 个芽条，能够做生根的有效芽为30~60条，切取健壮的芽条转移到White+0.2~1mg/LIBA+40mg/L，腺嘌呤+2%蔗糖或White+0.5mg/LIBA+4%蔗糖的生根培养基上进行培养，在室内散射光照条件，光照强度为2000~3000lx下，1~2周即开始发根，然后利用较强的自然散射光照光照强度为3000~5000lx进行培养10天左右，即可在苗的基部产生根而形成完整植株，一般发根率可达80%以上。

 2胚状体的诱导和生长

 第一取无菌种子或无菌发芽后的苗段接种在B5H或改良H成分为NH4NO348.8mg/LKNO341.6mg/L其余的与B5的成分相同，加0.8~1.0mg/LKIN+2mg/L~4mg/L2.4-D+4%~5%蔗糖的固体培养基上，放在28气温环境和12小时光照下培养3~4天可产生愈伤组织，经20余天迅速增殖成红里带白色的愈伤组织。

 第二把上述愈伤组织及时移到H或改良H+0.2~1.0mg/LBA+0.5mg/LNAA+3%~5%蔗糖的固体培养基上,在光和28下培养，这时愈伤组织增殖速度减慢培养1~2周，逐渐呈粉红色、表面光滑、结构致密、生机勃勃、再经3~6周培养愈伤组织表面更光滑，呈紫红色颗粒状，它就是胚性细胞团，从中可分化出许多胚状体。

 第三把这些细胞团接种在H或改良H+0.2mg/LBA+0.5mg/LNAA+3%~5%蔗糖的培养基上，培养约10~30天可长出大量绿苗、但发根少、因此把它移入H或改良H+0.5mg/L~1.0mg/LIBA+3%蔗糖的固体培养基上在28和光下培养6~8天，便会长成根系发达的完整苗木。

 第四桉树胚性细胞团可以较长期继代培养而不丧失分化能力但愈伤组织继代三次就会丧失分化能力继代用的培养基仍为前述的分化培养基继代时的胚性细胞团的大小,以0.1~0.2cm3为宜继代周期为15~30天以20天左右最佳。

 3组培幼苗的移植

 桉树组培苗经过诱导生根成苗其木质化程度还非常低瓶苗从无菌，光照、温度恒定、湿度饱和的人工控制培养条件下转入有菌、光、温、湿不易控制的外界环境时，这个过程使幼苗自身叶片的光合能力和根的主动吸收能力逐渐增强，叶片表面的保护层也逐渐形成，这时幼苗才算完成了从异养到自养的转变过程，因此，组培幼苗的移植必须按一定程序逐步进行。瓶苗发根率达80%以上时可移到室外在自然光下再培养6~10天，当小苗充分木质化，叶片舒展、叶色浓绿、茎轴、根系伸长时即可移栽出瓶外，育苗容器与

 基质配比与扦插苗培育相同，移栽前用0.15%~0.3%的高锰酸钾溶液进行基质消毒,倒出培养基，小心洗去残留在根上的培养基，并截去过长的根，保留2cm左右用0.1%的杀菌剂进行小苗消毒处理，根部再经IBA生根激素溶液处理后移入育苗基质中，置于育苗架上在70%遮光度的荫棚内培育25~30天移植初期要覆盖塑料薄膜保温保湿，等小苗高3cm生长稳定后即可进行露天炼苗当小苗长至15~20cm时可以出圃造林或用作扦插母株。

 同时在移栽过程中幼苗抗逆性差极易感霉菌死亡因此在高温高湿的温室或覆盖塑料薄膜的苗床上培育移植苗时，要注意温室或苗床的通透性，每周用0.1%的多菌灵等杀菌剂喷一次消毒灭菌。