ＲＡＰＤ技术在药用植物道地性研究中的应用

ＲＡＰＤ技术在药用植物道地性研究中的应用

【摘要】：综述了近年来RAPD技术在药用植物道地性研究中取得的主要进展，及其它分子标记在药用植物道地性方面的应用，并对该技术中存在的问题和今后应用进行讨论与展望。

【关键词】：药用植物；道地性；RAPD技术

中图分类号：S3文献标识码：B文章编号：1002-6908（2007）041****-02

在我国传统中医药的长期医疗实践过程中，药材的道地性一直是评价药材品质的独特的综合性标准[2]。由于道地药材与非道地药材来源于相同或相近的物种种类，在形态、生药性状及化学成分等特征上也常表现出高度的相似性，而传统方法对道地药材的鉴别十分困难的，有很大的主观性。随着分子生物学技术的快速发展，RAPD技术被广泛应用于药用植物的遗传多样性、亲缘关系、遗传育种和高含量株系筛选等研究中，从分子水平上阐明药材道地性形成的生物学实质和道地药材的快速、准确鉴定。近年来运用RAPD技术研究药用植物道地性的形成和道地药材的鉴定已引起相关学者的广泛关注，并取得成果。

1.RAPD技术在药用植物中的研究现状

RAPD技术是由J.G.K.Williams等人基于PCR技术原理而建立的,它反映了基因组相应区域DNA的多态性，较之传统的分析手段具有快速、微量、特异性强的特点；特别适合近缘种、破碎药材、腐烂药材及样品有限的植物模式标本、中药出土标本等珍贵样品的鉴定；多态性强，遍及整个基因组，对被测材料的要求不高，这些优点使RAPD技术在中药鉴定学研究中展示了良好的应用前景[3],为药用植物在基因定位和基因图谱的构建上提供了新的方法。

2.RAPD技术在药用植物道地性研究中的应用

如今，药材道地性研究已经成为中医药科研的重要课题，产生道地药材地域性现象，除了与栽培方法、生态环境、加工方法有关外，还与物种居群的遗传特异性有关，这可能是造成道地药材与非道地药材品质差异的原因。由于道地与非道地药材在形态和生药上基本一

致，因此，利用RAPD技术可以在DNA水平上鉴定两者的差异，使道地药材的研究提高到分子水平[4]。

当归(Anagelicasinensis(Oliv．)Diels)一般认为甘肃岷县道地产区，但甘肃省宕昌、武都、漳县以及四川省南坪等地的当归也作药用。为探讨当归药材道地性的遗传基础，高文远[5]等采用RAPD法对当归不同产区的18个样品进行研究，结果表明，基于当归RAPD多态性的聚类分析结果与当归主要产区的地理分布比较吻合，而且在同一地理分布范围内，当归的遗传背景与生态环境条件也存在一定程度的相关性，从而为从分子水平研究当归药材道地性形成机制提供了启示。

Zhou[6]等运用RAPD技术对芍药（Paeonialactiflora）种内栽培群体(白芍)和野生(赤芍) 群体的分子遗传分化特征和药材道地性形成关系进行了探讨，认为芍药种内变异除环境因素外，遗传分化是白芍和赤芍之间产生包括形态、化学在内的表型差异的主要原因，赤芍道地产区在大兴安岭多伦地区；而白芍栽培群体则完全按照传统道地产区不同分类，与观赏性的非道地群体存在分子变异。陈丙銮[7]等也对得到了基相似结论。

胡珊梅[8-9]等运用RAPD技术对福建、江西和四川3个产地的泽泻(Alismaorientalis)进行了基因检测分析，通过UPGMA分析，建泽泻与川泽泻有较近的遗传距离，与江泽泻均有较远的遗传距离，这与历来认为建泽泻与川泽泻质量较好，而以前者为优的评价一致。同时在对福建和广西2个产地间金线莲(Anoectochilusroxburghii)的RAPD指纹图谱进行分析，发现二者长期受多种生态环境的影响，已经产生了遗传变异，在GAP栽培或组织培养苗种选育时，广西金线莲植株较大，产量高，可作为优选种质资源。

徐朝晖等[10]采用RAPD技术对中药牛蒡子(Arctiumlappa)全国四大商品产区的商品药材和其中2个产区的饮片进行了DNA指纹图谱特征研究，发现4个产区牛蒡子干燥药材的图谱一致，而饮片与药材间存在较大差异，前者主要缺少较长碱基对的扩增条带，推测是由于高温炮制条件下DNA降解所致。

综上所述，RAPD技术已广泛应用药用植物道地性研究中，为了解和认识药用植物种群间、种类间、个体间以及野生种与栽培种之间的遗传差异，在中药鉴定研究中展示了良好的前景。

3.其它分子遗传标记技术在药用植物道地性研究上的应用

周联等[11]以各地产姜科药用植物阳春砂及常见伪品为材料，对其核内rDNA内转录间隔区(ITS)序列进行了测定和分析，结果表明，6个阳春砂和绿壳砂的ITS-2序列完全一致，各样品的5.8s序列也完全一致，但各样品在ITS-1中却有不同的碱基位点。据此，周联等认为，应用ITS-1序列可对阳春砂的道地性进行鉴别。李萍[12]等将5S-rRNA基因间隔区的序列分析应用于金银花(LonicerajaponicaThunb)的道地性研究也取得了很好的效果。此外，刘玉萍等[13]采用PCR直接测序技术分析了正品山药(DioscoreaPolystachyaTurcz．)与几个地方习用品的核基因组18SrRNA基因序列，及FushimiH[14]等对不同产地三七(Panaxnotoginseng)干燥药材的matK基因和18SrRNA基因进行测序分析研究，均得到了可靠的结果。

4．问题与展望

虽然RAPD技术已广泛应用与药用植物中，但由于其是显性遗传标记，不能识别纯合子和杂合子，无法评估等位基因频率，影响到扩增结果的再现性和应用的普遍性。针对这些问题，应尽量优化反应条件，避免模板DNA的降解，注意Tap酶和镁离子的浓度对扩增产物再现性的影响，筛选合适引物，增加反应的特异性和重复性，应用特征性片段扩增区域(SCAR)技术将RAPD转化为经典的PCR，以增加RAPD标记的稳定性和信息量。还可将几种相关的分子标记技术联合应用，如Um等[15]应用RAPD和PCR-RFLP技术对4个韩国与中国产地的人参进行了检测分析，表明这些方法可以用于不同产地人参的鉴定。

另外从已有的工作可以看出，许多研究在样品的取样数量和代表性方面还存在不同程度的不足。由于药用植物的遗传变异不但存在于居群之间，大量的变异也存在于同一个居群内部，而且居群的遗传结构受多种因素的影响。因此，建议在今后应用RAPD探讨药用植物道地性的研究中，应从居群水平出发，特别注意取样的代表性，以保证研究结果的可靠性．利用RAPD技术直接分析药材的DNA多态性，找出道地药材特有的DNA片段，对此进行测序，进而制备DNA探针，来检测相应的药材将是今后药用植物道地性快速、准确鉴定的重要研究方向。在道地药材的形成机制方面，郭宝林[16]等将RAPD技术与药用植物有效成分含量联系起来的研究方法为今后该方面的研究提供了思路。随着这些问题的解决和技术的优化，相信RAPD技术将在药用植物道地性研究和中药现代化的进程中发挥越来越重要的作用。

参考文献：

[1]王康正等.DNA分子诊断技术在药用植物研究上的应用[J].中国中药杂志.1997,22(12)

[2]肖小河等.中药DNA分子标识鉴定研究进展[J].中草药.2000,31(8);

[3]温海霞，蔡家利，邹姝姝.DNA分子标记在药用植物中的应用[J].细胞生物学杂志.2005

[4]舒艳群等.RAPD技术在药用植物学研究中的应用[J].中草药,1999,30(2)

[5]高文远等.当归药材道地性的RAPD分析[J].中草药，2001,32(10):926-929

[6]ZhouHT,HuSL,GuoBL,eta1.AstudyongeneticvariationbetweenwildandcultivatedpopulationsofPaeonialactifioraPal1.[J].ActaPharmSin，2002，37(5)

[7]陈丙銮,杭悦宇.白芍传统品种原植物遗传多样性及亲缘关系分析[J].植物资源与环境学报,2003,12(2)

[8]胡珊梅,周淘稻.道地药材建泽泻的RAPD研究[J],中草药,2002,33(2):．

[9]胡珊梅,张启国,袁文杰.珍稀中草药金线莲的RAPD研究[J],中草药,2000,31(12)

[10]徐朝晖,杨松松,康廷国.4种不同产地牛蒡子DNA指纹图谱特征研究[J].中草药,2001,32(6)

[11]周联,王培训,黄丰等.阳春砂的ITS序列分析[J].中草药,2002,33(1)

[12]李萍,蔡朝晖,邢俊波.5S-rRNA基因间区序列变异用于金银花药材道地性研究初探[J].中草药,2001.32(9)

[13]刘玉萍,何报作,曹晖.基因测序技术在中药质量研究中的应用(Ⅱ)—山药基原的DNA测序鉴别[J].中草药.2001,32(11):

[14]FushimiH,KomatsuK,NambaT,[J].PlantaMed,2000,

[15]UmJY,ChungHK,KimMS,-RFLP[J].BiolPBull,2001,2(4)

[16]郭宝林,吴勐,斯金平等.厚朴道地性的遗传学证据[J].药学实践杂志.2O00,18(5)