组织培养时各种灭菌特点

组织培养时各种灭菌特点

常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类,即：物理方法如干热（烘烧和灼烧）、湿热（常压或高压蒸煮）、射线处理（紫外线、超声波、微波）、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏水、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理.这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用.

 培养基在制备后的24小时内完成灭菌工序.高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内,其中的蒸汽不能外溢,压力不断上升,使水的沸点不断提高,从而锅内温度也随之增加.在0.1mpa的压力下,锅内温度达121℃.在此蒸汽温度下,可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢.

 注意完全排除锅内空气,使锅内全部是水蒸气,灭菌才能彻底.高压灭菌放气有几种不同的做法,但目的都是要排净空气,使锅内均匀升温,保证灭菌彻底.常用方法是：关闭放气阀,通电后,待压力上升到0.05mpa时,打开放气阀,放出空气,待压力表指针归零后,再关闭放气阀.

 关阀再通电后,压力表上升达到0.1mpa时,开始计时,维持压力0.1-0.15mpa,20分钟.

 到达保压时间后,即可切断电源,在压力到0.5mpa,可缓慢放出蒸汽,应注意不要使压力降低太快,以致引起激烈的减压沸腾,使容器中的液体四溢.当压力降到零后,才能开盖,取出培养基,摆在平台上,以待冷凝.不可久不放气,引起培养基成分变化,以至培养基无法摆斜面.一旦放置过久,由于锅炉内有负压,盖子打不开,只要将放气阀打开,大气压入,内外压力平衡,盖子便易打开了.

 对高压灭菌后不变质的物品,如无菌水、栽培介质、接种工具,可以延长灭菌时间或提高压力.而培养基要严格遵守保压时间,既要保压彻底,又要防止培养基中的成分变质或效力降低,不能随意延长时间.

 对于一些布制品,如实验衣、口罩等也可用高压灭菌.洗净晾干后用耐高压塑料袋装好,高压灭菌20-30分钟.

 高压灭菌前后的培养基,其ph值下降0.2-0.3单位.高压后培养基ph值的变化方向和幅度取决于多种因素.在高压灭菌前用碱调高ph值至预定值的则相反.培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时,高压灭菌后的ph值变化幅度较大,甚至可大于2个ph值单位.环境ph值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响.

 高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖,从而改变培养基的渗透压.在8%-20%蔗糖范围内,高压灭菌后的培养基约升高0.43倍.

 培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解,可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖.培养基值小于5.5,其水解量更多,培养基中添加0.1%活性炭时,高压下蔗糖水解大大增强,添加1%活性炭,蔗糖水解率可达5%.

 一、为防止高压灭菌产生的上诉一些变化可用下列方法：

 1、经常注意搜集有关高压灭菌影响培养基成分的资料,以便及时采取有效措施.

 2、设计培养基配方时尽量采用效果类似的稳定试剂并准确掌握剂量.如避免使用果糖和山梨醇而用甘露醇,以iba代替iaa,控制活性炭的用量（在0.1%以下）注意ph值对高压灭菌下培养基中成分的影响等.

 3、配制培养基时应注意成分的适当分组与加入的顺序.如将磷、钙和铁放在最后加入.

 4、注意高压灭菌后培养基ph值的变化及回复动态.如高压灭菌后的ph值常由5.8升高至6.48.而96小时后又回降至5.8左右.这样在实验中就可以根据这一规律加以掌握.

 二、用于无菌操作的器械采用灼烧灭菌

 在无菌操作时,把镊子、剪刀、解剖刀等浸入95%的酒精中,使用之前取出在酒精灯火焰上灼烧灭菌.冷却后,立即使用.操作中可采用250或500毫升的广口瓶,放入95%的酒精,以便插入工具.

 三、玻璃器皿及耐热用具采用干热灭菌

 干热灭菌是利用烘箱加热到160-180℃的温度来杀死微生物.由于在干热条件下,细菌的营养细胞的抗热性大为提高,接近芽孢的抗热水平,通常采用170℃持续90分钟来灭菌.干热灭菌的物品要预先洗净并干燥,工具等要妥为包扎,以免灭菌后取用时重新污染.包扎可用耐高温的塑料.灭菌时应渐进升温,达到预定温度后记录时间.烘箱内放置的物品的数量不宜过多,以免防碍热对流和穿透,到指定时间断电后,待充分冷凉,才能打开烘箱,以免因骤冷而使器皿破裂.干热灭菌能源消耗太大,浪费时间.

 四、不耐热的物质采用过滤灭菌

 一些生长调节剂,如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些微生物是不耐热的,不能用高压灭菌处理,通常采用过滤灭菌方法.

 一些化学成分在高温高压下回发生降解而失去效能或降低效能.经高温灭菌后赤霉素ga3的活性仅及不经高温灭菌的新鲜溶液的10%.蔗糖经高温后部分被降解成d-葡萄糖和d-果糖,果糖又可被部分水解,产生抑制培养的植物组织生长的物质.高温还可使碳水化合物和氨基酸发生反应.iaa、naa、2,4-d、激动素和玉米素在高温下是比较稳定的.维生素具有不同程度的热稳定性,但如果培养基的ph值高于5.5,则维生素b1会被迅速降解.泛酸钙、植物组织提取物等要过滤灭菌,不能高温灭菌,否则会失去作用.