芍药离体组织培养方法

  芍药是我国著名的观赏、药用植物，经过几千年的人工栽培选育，芍药优良品种的雄蕊、雌蕊大部分瓣化，结实率低，且由于异花授粉，种子也无法保持母本的优良性状。芍药养殖主要以分株为主，养殖系数低，给芍药产业化发展带来困难。芍药的离体培养研究目前做得较少，现将芍药离体组织培养方法介绍如下：

    供试材料中，种子、胚和上胚轴选自单瓣品种‘罂粟子’当年套袋成熟饱满的种子，茎尖选自重瓣型品种的休眠芽。
    种子采集接种时间分别为8月、10月、1月、3月，培养基选用1／2MS固体培养基，遮光处理。种子胚根长至3厘米以上时置于冰箱中4℃冷藏30天，后转至白天25℃、夜晚18℃的地方。叶片展开后进行芽增殖培养，光照每天12小时，光强1500至2000勒克斯。
    试验结果显示，用芍药种子作为外植体应保留种皮。去除种皮的种子接种2周后极易褐变被污染而死亡。少数种子的胚根伸长0.5厘米，也出现生长停止、逐渐死亡的现象。去除种皮使种子的胚乳与培养基直接接触，易导致褐变。未去除种皮的种子在40天左右陆续裂口，长出胚根。
    种子在试管中生根后，根生长缓慢，3个月未见上胚轴发芽展叶，且逐渐褐变死亡。而将发根后的试管苗置于冰箱中4℃冷藏，胚根生长加快，35天后上胚轴顶芽露出，转至组培室中。7天后子叶中间顶芽开始萌动，叶生长，20天后叶柄伸长展开。一般一粒种子仅展开一两片叶子，少数种子形成两个胚轴，展开三四片真叶。
    试验结果表明，以8月、10月、1月接种的种子成活率较高，需经过40至60天后才开始生根，经过低温处理，打破上胚轴休眠后大都能展叶。
    芍药种子萌发的实生无菌苗生长缓慢，与自然界中芍药实生苗一样，只生长一两个叶片，无法连续生长。在所试的5种培养基上，不同时期的种子无菌苗均不能增殖和生长。切取无菌苗的上胚轴转接后，也不能分化出丛芽，主要表现为上胚轴对不同浓度的BA（细胞分裂素）、GA（赤霉素）均不敏感，生长处于停滞状态，部分外植体基部产生褐变，部分芽尖、叶逐渐枯死。
    胚与上胚轴的培养，接种至1／2MS＋BA＋0.2NAA（萘乙酸）和1／2MS＋0.5BA等培养基，pH值调至5.8。为防止褐变，每升添加50至100毫克维生素C，0.3％至0.5％活性炭，培养室温度25℃±1，每天光照10小时，光强2000勒克斯。
    去除了胚乳的胚体积很小，仅两三毫米，接种在培养基上20天后子叶能在试管中展开，胚根稍有伸长，但胚芽始终未见生长，转接至不同培养基结果相同。原因很可能是种子胚乳中存在一定活性物质或胚中存在一定抑制物质，只有与胚乳和胚根共同生长，合成的某种促进物质或解除抑制物质可以协调内源激素关系，促进胚芽生长。
    低温打破休眠后将上胚轴接种在培养基上。30天之后，叶柄伸长，叶展开，较小，表面皱缩，比接种的种子无菌苗小，易发生褐变。培养基添加活性炭后，可明显减少褐变污染。幼苗形成后即出现生长停滞状态，转接含不同激素的培养基，变化不大。推测上胚轴生长后处于生理休眠期，休眠解除可能需要一个变温过程。茎尖培养一部分取地栽苗的休眠芽，剪取带芽鳞的茎尖进行试验，另一部分于9月下旬掘起植株，置于4℃湿土中，5周后取芽。除去芽鳞，切取茎尖，用0．1％次氯酸钠溶液消毒15分钟，无菌水冲洗3至5次，分别接种到以下3种培养基中：
    ①1／2MS＋0.5BA＋GA
    ②1／2MS＋1.5BA＋0.5KT
    ③1／2MS＋1.0BA＋0.5GA
    pH值5.6，蔗糖3％，琼脂0.8％，50毫克／升维生素C，培养室温度25℃±1，每天光照14小时，光强2000勒克斯。
    不同取样时间对茎尖培养有影响。露地栽培取材时间在10月至11月，或于9月下旬掘起茎芽，置4℃冷藏处理5至6周，成活率和分化率最高。此时接种，休眠芽萌动，生长迅速，分化的试管苗健壮。取材时间在2月，4℃冷藏8至9周的大部分材料芽鳞已经裂开，芽已伸长，消毒困难，污染率高。其他时间因芽的休眠尚未彻底解除，内部存在抑制物质，生长缓慢，成活率和分化率均较低。因此，茎尖培养的适宜取材时间应为10至11月或4℃冷藏5至6周。
    从不同培养基对芽增殖的影响来看，BA和GA组合的培养基芽分化效果优于BA与KT组合。1.5BA＋0.5KT培养基中丛生芽、叶片数量较少，苗生长较高。在添加BA、GA的培养基中，丛生芽、叶片数量较多，苗壮。继代培养中，切取诱导芽单芽接种，35至40天后基部形成新芽。但随着代数增加，丛生芽和叶的数量逐渐减少，苗生长变弱，部分芽尖、叶枯死，出现白化苗。到第四代已基本转为玻璃苗、白化苗，褐变严重。芽增殖以1／2MS附加0.5BA和1.0GA为最佳培养基。