卡特兰的组培快繁技术

1 .采样与消毒

采芽的时间一般选在冬季, 此时引起褐变的物质含量低, 采芽的成活率高。不过, 并非所有品种都可如此处理, 有些品种在冬季是不长新芽的。采样时, 选取新生假球茎( 老球茎生长点多已停止发育, 且易污染) , 把新茎从母株的着生部位切下, 一边在流水中冲洗, 一边从外侧按顺序剥除叶片, 最后用锋利的刀将切口和脏物削掉。消毒剂可用酒精、漂白粉等。消毒时最好用有盖的瓶子, 一边消毒, 一边摇动, 减少气泡附着。消毒完后, 用无菌水冲洗材料数次, 然后按无菌操作要求取芽。取芽应选茎中间部位的大芽, 因为其成活率和生长率都比较高。取芽的方法有两种: 一种为摘出法。先将芽切下, 并将下面的切口切去少许, 然后自上轻压, 将芽压出, 如此重复1～2 次, 就可得到0 .5～1 .0 毫米的外植体( 此法需小心、熟练, 切口切得太长会切掉生长点, 过短则挤不出) ; 另一种方法是首先连苞叶进行同样的液体培养, 之后除去苞叶, 将仅附周围组织的生长点移到固体培养基上。后一种方法的成活率、萌芽率相对较高。外植体的大小, 以脱毒为目的应为0 .2～0 .3 毫米, 以增殖为目的一般取0 .4～0 .6 毫米以上,具体应根据卡特兰的类型而定。其中, BLC 系大型卡特兰茎尖可达1 .5～2. 0 毫米, SLC 系小型卡特兰茎尖可取0 .5～2. 0 毫米。

2 .初代培养

初代培养时, 可以选用的培养基有: MS+ 0 .1 毫克/ 升萘乙酸+ 10% 椰乳+ 2% 蔗糖, 或MS+ 1 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 1. 0 毫克/ 升萘乙酸的固体培养基, 或1/ 2MS(去除甘氨酸) + 0 .1～1. 0 毫克/ 升萘乙酸+0 .1～1. 0 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 2%蔗糖。基本培养基还可选Nitsch、B5 或卡特兰专用培养基等。天然有机物的添加, 需根据具体情况经过实验确定。培养基的pH值以5 .5～6 .0 为好。

将摘出的生长点移植到液体培养基静置培养, 培养一周后更新培养液, 3 周后移至固体培养基。初代培养的温度以15～20 ℃成活率最高, 成活后25 ℃ 有利于增殖。光照多用2 000 勒连续照明。

3 .球茎的增殖和器官形成

通过初代培养的原球茎应尽早增殖为好。芽在培养基上培养2 个月后, 纵切4 块, 移至继代培养基中增殖, 以后每隔一个月分割继代一次。虽然卡特兰可在液体静置培养中增殖, 但质地比较疏松, 时间太久还会使原球体死亡。

防止办法是液体培养与固体培养交替进行, 交替时间以一个月左右效果较好。液体培养会抑制原球体分化芽, 使原球体大量增殖,转至固体培养能使之生长健壮。在芽未分化时移到液体培养基,可使芽分化受到抑制, 使原球体增殖。如此反复做液体和固体培养, 可使原球体无限增殖。但长时间( 约3 年以上)的继代培养有可能产生变异株。因此, 以生产与母株相似的幼苗为目的, 其继代应是有限的。将固体培养基上形成的原球体块一个个分离转移到液体培养基时, 切伤面应尽可能小。原球体增殖可使用如下培养基:MS( 附录表1 1) + 0 .1～5. 0 毫克/ 升6 苄基腺嘌呤+ 0 .5～1. 0 毫克/ 升萘乙酸, 或添加某些有机物如150 克/ 升香蕉, 150毫升/ 升椰乳。

当增殖到一定数量后, 便可将原球体移到成苗培养基Knudson+ 0 .18 毫克/ 升萘乙酸+ 0 .02 毫克/ 升激动素+0 .175 毫克/ 升赤霉素+ 30 克/ 升蔗糖+ 6 克/ 升琼脂上, 经1～2 个月, 所有原球茎体便可生根成苗。分化芽的幼苗也可使用MS+ 0 .1～1. 0 毫克/ 升激动素+ 1 .0～5 .0 毫克/ 升萘乙酸, 或MS+ 0 .1～5 .0 毫克/ 升激动素+ 0 .1 毫克/ 升2 , 4 二氯苯氧乙酸的培养基。

4 .壮苗培养和试管苗出瓶

当苗长至15～25 毫米时可转入壮苗培养基, 以促进茎、叶和根的生长。壮苗培养基可用总离子浓度为30～35 摩尔/ 升的基本培养基, 加香蕉5%～10%。

出瓶苗可移入装有水苔或泥炭藓、珍珠盐、蛭石混合的培养土的营养钵中, 适宜温度为15～25 ℃。此外, 需进行遮光培养, 夏季以遮光80%、冬季遮光50%为宜。

5 .褐变的产生及防止

卡特兰接种后易褐变, 成活率低。褐变是一种酚类化合物在有氧条件下被多酚氧化酶作用的结果。引起褐变的物质的量与采芽的时间和新茎的大小有关。

防止褐变的措施有:

①在冬春季采样, 选取8～15 厘米长的新茎;

②消毒后用无菌水冲洗干净, 并在无菌水中切割材料, 或切后在无菌水中浸1～2 分钟;

③ 在培养基中加入褐变防止剂芸香甙( rutin)50～100 毫克/ 升;

④从开始培养至成活, 温度保持15～20 ℃。在25～30 ℃下培养, 褐变物质渗出量很大。

⑤ pH 值调至5 .5;

⑥外植体先用液体静置培养, 成活后再转固体培养。