植物生物反应器生产医用口服疫苗的研究进展

植物生物反应器生产医用口服疫苗的研究进展

【摘要】：转基因植物作为生产口服疫苗的生物反应器，提供了安全廉价的生产体系，比起动物反应器所存在的伦理问题，转基因植物也更易被人们普遍接受。

【关键词】：转基因；植物；口服疫苗

一、植物生物反应器生产口服疫苗的优势

与转基因动物、病毒、细菌等可生产重组疫苗的系统相比较，植物生物反应器更易于推广，获得稳定遗传的转基因植物种系后，比较容易建立低成本的大规模生产系统 ；免疫接种时不需使用注射器等，从而降低了免疫接种时人的应激反应；口服后诱导的抗体具有生物活性 ，可引起粘膜免疫应答[1] , 口服免疫途径与注射免疫途径一样可有效诱导实验动物产生免疫反应[2]。因此，利用转基因植物生产口服疫苗在20世纪90年代后成为热点研究课题。

二、植物生物反应器生产医用口服疫苗

（一）植物生物反应器产乙肝疫苗

乙型肝炎是危害人类健康最严重、传播范围最广的传染病之一，目前控制乙型肝炎唯一经济有效的办法就是接种乙肝疫苗。Mason 等（1992）首次实现了 HBsAg在转基因烟草中的表达,表达的 HBsAg为22 nm左右的颗粒 ,与从HBV患者血液中分离出的 HBsAg 病毒样颗粒的大小相一致，表达量占烟草中总可溶蛋白的0.01%。随研究的深入，表达蛋白的转基因植物种类逐渐增加，先后实现了HbsAg在马铃薯、莴苣、大豆等植物中的表达。我国学者郝浩永等（2007）将构建好的植物表达载体pCAMBIA1301/HB转化到根癌农杆菌LBA4404中，并通过农杆菌介导转化番茄。所得再生植株经PCR和Southern杂交鉴定确认成功整合了HBsAg基因。

（二）植物生物反应器产结核疫苗

结核病是危害人类健康历史久远的慢性传染病。利用转基因植物口服疫苗可降低成本以及感染的可能性。王凌健 等（2001）以胡萝卜无菌幼苗的子叶和下胚轴为外植体 ,通过携带MPT64 基因的根癌土壤杆菌的介导进行转化 ,经胚状体发生途径分化得到抗性苗 。经 PCR 、 Southern、Western等方法鉴定 ,确认结核杆菌分泌蛋白MPT64 基因已整合到胡萝卜的染色体中且在转基因胡萝卜的蛋白质中含有 MPT64 分泌蛋白 ,为进一步研究利用转基因植物研制口服疫苗和防治肺结核的新型疫苗提供了新材料[3]。

张更林, 周鹏等（2003）对结核杆菌分泌蛋白 ESAT26基因进行了修饰改造 , 构建了带潮霉素选择抗性基因的植物表达载体和根癌农杆菌工程菌; 采用叶盘法转化热带水果番木瓜, 获得13株抗性植株 ,确认了4株为转基因植株[4]。

随着对结核疫苗的研究深入，相关控制试验也相继开展。转基因植物疫苗的研究过程中，抗生素的浓度控制是一个重要环节，我国学者刘凤娟 ,陈清等（2007）证明，进行结核病番茄疫苗研究时卡那霉素选择压以1010mg/L 为宜。不定芽分化阶段宜用 50010mg/L 羧苄青霉素 ,生根阶段宜用50010mg/L 头孢霉素。针对子叶再生愈伤组织和不对芽再生根两次筛选 ,敏感、快速 ,节约筛选时间[5]。

（三）植物生物反应器产狂犬病疫苗

狂犬病由病毒引起，是一种急性中枢神经系统传染病，目前只能通过疫苗来防止发病。 1995年，McGarvey等用转基因番茄成功表达了狂犬病病毒的衣壳蛋白，为植物产口服蛋白提供了良好的工具[6]。之后Modelska 等（1998）在重组的苜蓿花叶病毒表达了狂犬病毒表面抗原并首次报道了植物病毒表达的疫苗经口服免疫后所引发的粘膜免疫应答。试验中以两种不同的方式进行免疫，一组将纯化的病毒颗粒关注入小鼠消化道，另一组用感染病毒的菠菜叶饲喂小鼠，第一组用的抗原量为第二组的10倍，但第二组小鼠的抗病毒IgA水平是第一组的2倍。由此说明植物组织可在消化道环境中对抗原进行保护。

Yusibov 等(2002)在志愿者试验中 ,让9名未注射过狂犬病疫苗的志愿者食用了转基因菠菜叶后,有6人产生了低浓度的中和性抗体 , 再给这9个人注射传统的狂犬病疫苗 ,产生中和性抗体的6名志愿者中有3人产生了高浓度的中和性抗体。这证明了转基因植物狂犬病疫苗对传统疫苗起补充和增强作用[7]。

（四）其他应用

随着基因工程以及植物组织培养技术的发展，利用转基因植物产生口服疫苗的进程逐步加快，所用植物的范围也不断扩大，也延伸到多种医疗常用疫苗。目前用作生物反应器来长生疫苗的植物主要有：烟草、番茄、马铃薯、胡萝卜、菠菜、香蕉、木瓜等，疫苗针对的疾病主要有肠道感染、艾滋病、霍乱、乙肝等。

三、展望

用转基因植物作为生物反应器生产口服疫苗为医用疫苗的生产提供了新的途径，越来越多的科研与商业机构的关注，对转基因植物疫苗的研究起了很大的推动作用。但对其存在的问题，我们应给予高度重视，尤其是安全性方面更应进行进一步验证。目前存在的问题主要有：疫苗在植物中的表达水平和稳定性 , 转基因植物口服疫苗的免疫有效性 , 受体植物的选择和生物安全性等。 进一步的严谨验证试验必将使转基因植物疫苗的道路更加光明。

参考文献

[1] Curtiss RI, Cardineau CA. World Patent Application, 1990 ,WO 90/02484.

[2] 郑雨燕, 凌均, 麦穗等. 转基因番茄可食用防龋疫苗免疫 BALB/c鼠的实验初探[J].口腔医学研究, 2007，23(1)：7-9.

[3] 王凌健, 倪迪安, 等. 利用转基因胡萝卜表达肺结核疫苗.植物学报. 2001,43(2):132-137.

[4] 张更林, 周鹏, 等. 转基因番木瓜作为抗结核植物口服疫苗的初步研究. 云南植物研2003, 25(2):223-229.

[5] 刘凤娟, 陈清, 等. 抗生素在结核病番茄疫苗研究中的应用. 中国热带医学2007，7（3）：321-327.

[6] Peter B. McGarvey, John Hammond, Margaret M. Dienelt, et al. Expression of the rabies virus glycoprotein in transgenic tomatoes. Bio/Technology, 1995,19: 1484-1487.

[7] Yusibov V, Hooper DC, Spitsin SV. Expression in plants and immunogenicity of plant virus-based experimental rabies vaccine.Vaccine. 2002 ,20(25-26):3155-64.