叶绿体DNA分析技术及其在栗属植物中的应用

  摘要：被子植物叶绿体DNA母性遗传，有独立的进化路线，基于叶绿体DNA的分析技术在分子系统学、资源多样性评价、杂种鉴定等方面具有重要作用。栗属植物资源丰富，分布广泛。概述了叶绿体DNA分析技术在栗属植物中的研究进展，阐述了包括PCR—RFLP、DNA杂交、叶绿体SSR标记技术和叶绿体基因区段测序分析技术在内的分子标记技术的原理、特点及其在栗属植物中的应用。并对今后如何开发叶绿体DNA标记用于栗属植物的研究进行了展望。

  关键词：栗属植物；分子标记；叶绿体SSR标记；PCR—RFLP标记；叶绿体基因区段测序分析技术
  中图分类号：S664.2 文献标识码：A
  文章编号：1009-9980(2008)03-396-04
  壳斗科栗属[Castartea(Tourn.)L.]植物广泛分布于欧洲、亚洲及北美大陆的温带区域，是世界上重要的果树作物之一。栗属植物种类和类型繁多，John-son把栗属划分为7个种：板栗(C.mollissima B1.)、茅栗(C.seguinii Dode.)、锥栗[C.henryi(Skan)Re-hder&Wilson]、日本栗(C.crenata Sieb.&Zucc.)、欧洲栗(C.sativa Mill.)、美洲栗[C.dentate(Marsh.)Brokh]、榛果栗(C.pumila Mill.)。分布在亚洲的有4个种，即日本和朝鲜半岛的日本栗以及我国的特有种一板栗、茅栗和锥栗。我国是栗属植物遗传多样性中心，而中国板栗是栗属资源的原生种，分布地域广，对栗疫病具有极强的抗性。欧洲栗仅分布于欧洲，东土耳其为其次生起源和遗传多样性中心。美洲栗和榛果栗分布于北美洲。近年来，随着分子标记技术的迅速发展和广泛应用，利用叶绿体DNA分析技术研究栗属资源取得了重要进展。作者介绍了叶绿体基因组的结构特点、几种叶绿体DNA标记技术的原理及其在栗属植物中的应用进展，为进一步保护和持续利用栗属植物资源提供借鉴。
  1、 叶绿体基因组序列的特点
  叶绿体DNA(chlproplast DNA.cpDNA)是1962年在藻类中发现的，大多数植物的cpDNA为闭环双链DNA，原核生物型，大小为120～220 kb。含有2个长约22～25 kb的反向重复序列(Inverted repeat se-quence，IR)、大单拷贝区(Large single-COpy region，LSC)和小单拷贝区(Small single-copy region，SSC)。近年来许多植物分子系统学和遗传分析研究都基于对coDNA的比较分析，是因为叶绿体基因组序列有如下的特点和优点：第一，cpDNA分子量小，多拷贝和结构简单，有利于对叶绿体基因组进行分析。第二，与含有较多重复序列的核基因组和频繁发生重排事件的线粒体基因组不同，叶绿体基因相当保守。突变类型主要表现为点突变、碱基插入或缺失，进化速率平均每年每个位点约为0.2～1.0×109，仅为核基因的1/3。叶绿体非编码区DNA进化速率普遍高于编码区序列，可分别适用于不同分类水平的系统演化。第三，cpDNA单性遗传，有独立的进化路线，不依赖于其它任何数据即可构建分子系统树，可为从历史和系统发育的角度解释生物多样性提供可靠和准确的信息。
  2、cpDNA的PCR—RFLP分析技术
  在细胞质基因组分析中，基于PCR的RFLP分析方法比RFLP技术揭示的多态性更丰富，结论更可靠。因此，cpDNA的PCR-RFLP分析已成为目前叶绿体DNA系统学研究中使用最为广泛的技术，也是遗传多样性研究、物种鉴别、杂种鉴定等研究领域的有力工具。PCR-RFLP主要用于碱基变异分析与比较，首先利用叶绿体保守引物扩增特异区段，然后利用某种限制性内切酶酶切处理。单碱基突变或序列重排的发生，可使某种限制性内切酶酶切位点增加。减少或消失，导致限制性酶切片段长度发生改变，产生了限制性片段长度多态性。
  PCR-RFLP分析中，最关键的是叶绿体引物的开发和选择，现已有大批叶绿体PCR引物相继报道。其中部分引物跨物种使用成功，从而发展成为通用引物(universal primer)，通用引物的使用对于研究遗传背景不清的叶绿体DNA提供了极大的便利。
  在山毛榉科植物中，Magni等对Quercus rubra的cpDNA的多样性进行PCR-RFLP分析，并同其它山毛榉科植物进行比较，结果表明，3个拥有共同生活史的品种间存在很大差异。Vettori等对意大利山毛榉(Fogus sylvatica)居群的cpDNA进行PCR-RFLP分析，结果表明，在山毛榉cpDNA中有一个显著突变标记，可用于对意大利的山毛榉自然群体进行细分，并且研究证明意大利南部的山毛榉群体变异度最高。在栗属植物中，Fineschi等㈣对38个欧洲栗居群进行了叶绿体的PCR-RFLP分析，检测到11种类型的叶绿体单倍型(haplotype)，而且证明cpDNA的遗传多样性与地区性关系并不密切，这些欧洲栗居群呈现出的种内多态性可能是受到几千年来人类活动的影响产生的。
  3、DNA杂交技术
  叶绿体DNA杂交技术是指利用限制性内切酶消化总DNA，凝胶电泳后分离的DNA片段转移到尼龙膜上，利用同位素或生物素标记探针(异源的或同源的叶绿体基因片段)进行杂交，最后比较杂交谱带的差异。可以利用这一技术研究植物类群间的亲缘关系、遗传多样性、分类和系统进化。它依据的原理是不同来源的基因片段部分同源，通过变性解链后互补的DNA重新复性，成为异源双链的过程。在这一标记技术中为了取得比较理想的实验结果，往往使用同位素标记探针，而且需要提取大量的总DNA，实验周期长；再者由于叶绿体基因高度保守，不易发生基因重排等原因，利用大的同源片段杂交在较低的分类学层次上很难检测到变异类型，因此限制了这一技术在栗属植物中的应用。迄今还未发现利用异源的叶绿体探针研究栗属资源的报道。
  4、COSSR技术
  叶绿体SSR(Chloroplast Simple Sequence Re-peat，cpSSR)标记是近年来新发展起来的一种分子标记，最先由Powell等提出，并在松树中筛选出了第1批cpSSR引物。CpSSR的原理与核基因组SSR相同，都是以简单重复序列作模体，根据模体两端的保守序列设计引物进行扩增，因简单序列的重复数的不同而表现出多态性。叶绿体基因组中的微卫星序列可以作为一种通用标记来估计植物种群的遗传结构、遗传资源多样性以及研究质体的遗传方式。由于cpSSR标记技术同时具有SSR标记的优点又兼顾叶绿体基因组的特点，操作简便，多态性揭示能力。