紫萁组织培养的探讨二

  结果与分析
    3．1孢子粉与孢子囊消毒效果比较
    由表1可知，孢子粉的消毒效果比孢子叶小叶效果差，不仅污染率高，而且容易褐化死亡，继续培养无孢子萌发。小叶的孢子处在孢子囊壳的包被保护之中，受外界病菌侵染程度轻，表面消毒时受消毒液的影响也较小。此外，孢子粉个体微小，表面消毒操作难度大，且由于经过干燥散落的后熟过程，夹杂的杂物较多，生活力会有所降低。故以孢子叶小叶整体表面消毒比孢子粉消毒要理想的多。

    3．2不同激素对紫萁孢子萌发的诱导效应。
    由表2可以看出，培养基中激素的浓度高低对孢子萌发无显著影响，不加任何激素与附加低浓度激素(低于1.0mg／L)，同样有很高的孢子萌发率，但浓度太高(2.0～5.0mg/L)会抑制孢子萌发。另一方面，无机盐浓度对孢子萌发影响较大，较低的无机盐浓度促进孢子萌发，将MS培养基中无机盐浓度减半是合适的。
    3．3不同糖浓度对孢子萌发率的影响
    由表3可知，糖浓度对孢子萌发影响较大，在2%～3%范围内较合适，低于2%和高出4%，孢子萌发率明显降低。以食用白砂糖代替化学纯蔗糖，对孢子萌发率基本上无影响，取材方便，且可降低费用成本。
    3．4不同影响因子对原叶体的增殖效应
    3．4．1温度对原叶体的增殖效应
    由表4可知，培养温度对原叶体增殖影响较大，25"C左右是原叶体增值的适宜温度，低于20"C或昼夜有温差波动都对原叶体增殖有抑制作用。无机盐浓度对原叶体增殖无明显影响，MS和1／2MS培养基均适合原叶体增殖生长。
    3．4．2活性炭与KH2P04对原叶体的增殖效应
    由表5可知，培养基中附加少量活性炭和KH2P04对原叶体增殖和生长有促进作用。原叶体在增殖生长过程中，对P、K元素的需求量大，大棚人工播撒孢子养殖试验中，在原叶体增殖生长时期隔天喷施200mg/LKH2P04溶液代替浇水，对原叶体旺盛生长有明显的促进作用，在组培中效仿也是合适的。活性炭可以吸附培养基中积累的有害物质，从而更利于原叶体的增殖和生长。
    3．4．3不同激素对原叶体的增殖效应
    由表6可知，不同激素对原叶体增值的影响较明显。6-BA和NAA在较低浓度时，对原叶体增殖效果较好，当浓度高于2.0mg／L时反而对原叶体生长不利，出现白化苗现象；2,4-D对原叶体增殖效果较好，但片状体皱褶严重，不舒展饱满；高浓度的KT有利于原叶体的增殖和生长。 
    由表7可知，6-BA0.5mg／L+NAA0.5mg/L、6-BA1.0mg／L+NAA0.5mg／L、NAA0.5mg／L+KT5.0mg／L和NAA1.0mg／L+KT5.0mg／L都能促进原叶体增殖，并能生长良好。6-BA0.5mg／L+NAA1.0mg／L分化出假根的能力最强，可用于孢子体生根培养基。 
  3．5炼苗与移栽
    孢子囊无菌培养约四个月后，在浓绿肥厚的原叶体上开始出现幼孢子体，在培养基营养供给充足的条件下，20d左右即可进行炼苗．由于离体条件培养下的再生植株长期在营养丰富的无菌条件下生长，根系活动能力低，直接移入土壤中栽培对外界环境适应力极差，成活率极低。在培养室条件下选择3条根以上、根系粗壮、3叶以上且叶长3～4cm的绿色完整植株，置于大量元素稀释100倍的培养液浸泡过的干净沙砾中培养一周，其间要经常用纯净水清洗去根上残余的琼脂，不断补充培养液，使植株逐渐适应外界环境．再转移至室内自然条件下培养一周后，接入配备好的砂土中栽植，细心管理，半个月后可移至室外，成活率可达80%。另在遮阳网大棚内保持湿度90%以上，保持温度20-28℃，散射光照条件下，以同样基质炼苗移栽，效果也较好，成活率可达60%。炼苗时间过短，砂培改为水培，成活率均有下降。 
    讨论与小结
    紫萁孢子无菌培养途径孢子囊萌发率高，质地均一，生长势良好，没有病害坏死等不良症状，但存在成本高、耗费人工、炼苗时间较长导致成活率下降等缺点。无菌培养技术，目前还处在摸索阶段，不能将被子植物组织培养技术直接照搬。被子植物从外植体到成苗移栽一般只需帅天左右，紫萁属较低等的蕨类植物，有其独特的生活史，自然条件下从孢子成熟到萌发成孢子体需四个月左右，到基本上能移栽到大田栽培则共需要约六个月。目前的无菌培养技术和温室基质育苗都很难显著缩短其生活周期，只能作为补充自然生态环境下资源不足的人工养殖手段。
    孢子粉的消毒效果比孢子叶小叶效果差，不仅污染率高，而且容易褐化死亡，继续培养无孢子萌发。孢子叶小叶整体表面消毒比孢子粉消毒要理想的多。激素浓度高低对孢子萌发无显著影响，不加任何激素与附加低浓度激素(低于1.0mg/L)，同样有很高的孢子萌发率，但浓度太高(2.0~5.0mg/L)会抑制孢子萌发．无机盐浓度对孢子萌发影响较大，较低的无机盐浓度促进孢子萌发，将MS培养基中无机盐浓度减半是合适的。
    糖浓度对孢子萌发影响较大，在2%～3%范围内较合适，低于2%和高出4%，孢子萌发率明显降低。以食用白砂糖代替化学纯蔗糖，对孢子萌发率基本上无影响。
    温度对原叶体增殖影响较大，25"C左右是原叶体增值的适宜温度，低于20"C或昼夜有温差波动都对原叶体增殖有抑制作用。无机盐浓度对原叶体增殖无明显影响，MS和1／2MS培养基均适合原叶体增殖生长。培养基中附加少量活性炭和KH2P04对原叶体增殖和生长有促进作用。
    6-BA和NAA在较低浓度时，对原叶体增殖效果较好，当浓度高于2.0mg／L时反而对原叶体生长不利，出现白化苗现象；2,4。D对原叶体增殖效果较好，但片状体皱褶严重，不舒展饱满：高浓度的KT有利于原叶体的增殖和生长。6-BA0.5mg／L+NAA0.5mg／L、6-BA1.0mg／L+NAA0.5mg／L、NAA0.5mg，L+KT5.0mg／L和NAA1.0mg／L+KT5.0mg/L都能促进原叶体增殖，并能生长良好，具体哪一种促进原叶体增殖效果最好，还有待进一步深入研究。6-BA0.5mg／L+NAA1.0mg／L分化出假根的能力最强，可用于孢子体生根培养基。
    此外，培养基的质地对原叶体的快速增殖也影响较大。表面有水渍，质地膨松，轻敲有晃动感，挖去一小块即有明水填充的培养基，原叶体增殖比质地坚硬的培养基要明显加快，长出孢子体的时间要早10d左右，且生长状况良好。
    原叶体增殖培养是紫萁孢子萌发途径中最重要的一个环节，只有原叶体生长状况良好，积累足够的养分，在外界条件合适的情况下，才能完成受精产生孢子体。如何缩短原叶体增殖周期，尽量节约成本，提前出苗，将是紫萁孢子萌发培养中的重要议题。