组织培养中的清洗、消毒灭菌技术

组织培养中的清洗、消毒灭菌技术

清洗 植物组织培养用的各种玻璃器皿，特别是培养瓶和盛培养基的器皿，一定要严格清洗，以防油污、重金属离子、酸、碱等有害物质残留在瓶内，影响培养物的生长。使用过的玻璃器皿应及时清洗，先将污物如培养基、培养物倒掉，再浸入水中，然后洗涤。玻璃器皿的洗涤，可根据器皿的污染程度和性质，采用不同的方法，通常有碱洗法和酸洗法。凡有微生物污染的器皿，必须先进行高压消毒和煮沸，以杀死菌体，否则会产生孢子飞扬，污染环境，给组织培养带来严重困难。器皿洗净后，应烘干或晾干，放在规定的地方，便于取用。

   常用的灭菌方法可分为物理的和化学的两类，即：物理方法如干热、湿热、射线处理、过滤、清洗和大量无菌水冲洗等措施；化学方法是使用升汞、甲醛、过氧化氢、高锰酸钾、来苏儿、漂白粉、次氯酸钠、抗菌素、酒精化学药品处理。这些方法和药剂要根据工作中的不同材料不同目的适当选用湿热灭菌培养基在制备后的24h内完成灭菌工序。高压灭菌的原理是：在密闭的蒸锅内，其中的蒸气不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在o．1mpa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸气温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。注意完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。高压灭菌放气有几种不同的做法，但目的都是要排净空气，使锅内均匀升温，保证灭菌彻底。常用方法是：关闭放气阀，通电后，待压力上升到o．05mpa时，打开放气阀，放出空气，待压力表指针归零后，再关闭放气阀。三次放气后，关阀再通电，压力表上升达0．1-0．15mpa时，维持15-20min。•对高压灭菌后不变质的物品，如无菌水、栽培介质、接种用具，可以延长灭菌时间或提高压力。而培养基要严格遵守保压时间，既要保压彻底，又要防止培养基中的成分变质或效力降低，不能随意延长时间。对于一些布制品，如实验服、口罩等也可用高压灭菌。洗净晾干后用耐高压塑料袋装好，高压灭菌20-30min。高压灭菌前后的培养基，其ph值下降0.2-0.3单位。高压后培养基ph值的变化方向和幅度取决于多种因素。在高压灭菌前用碱调高ph值至预定值的则相反。培养基中成分单一时和培养基中含有高或较高浓度物质时，高压灭菌后的ph值变化幅度较大，甚至可大于2个ph值单位。环境ph值的变化大于0.5单位就有可能产生明显的生理影响。高压灭菌通常会使培养基中的蔗糖水解为单糖，从而改变培养基的渗透压。在8%-20%蔗糖范围内，高压灭菌后的培养基约升高0．43倍。培养基中的铁在高压灭菌时会催化蔗糖水解，可使15%-25%的蔗糖水解为葡萄糖和果糖。培养基值小于5.5，其水解量更多，培养基中添加0.1%活性炭时，高压下蔗糖水解大大增强，添加1%活性炭，蔗糖水解率可达5%。

   灼烧灭菌•在无菌操作时，把镊子、剪子、解剖刀等浸入95%的酒精中，使用之前取出在酒精灯火焰卜灼烧火菌。冷却后，立即使用。操作中可采用250或500ml的广口瓶，放入95%的酒精，以便插入工具。

   干热灭菌干热灭菌是利用烘箱加热到160-180~c的温度来杀死微生物。由于在干热条件下，细菌的营养细胞的抗热性大为提高，接近芽抱的抗热水平，通常采用170℃持续90min来灭菌。干热灭菌的物品要预先洗净并干燥，工具等要妥为包扎，以免灭菌后取用时重新污染。包扎可用耐高温的塑料。灭菌时应渐进升温，达到顶定温度后记录时间。烘箱内放置的物品的数量不宜过多，以免妨碍热对流和穿透，到指定时间断电后，待充分冷凉，才能打开烘箱，以免因骤冷而使器皿破裂。干热灭菌能源消耗太大，浪费时间。

   过滤灭菌一些生长调节剂，如赤霉素、玉米素、脱落酸和某些维生素是不耐热的，不能用高压灭菌处理，通常采用过滤灭菌方法。可用无菌的孔径0.20-0.45um的硝酸纤维素膜过滤菌类，当溶液通过滤膜后，细菌的细胞和真菌的孢子等因大于滤膜直径而被阻，在需要过滤灭菌的液体量大时，常使用抽滤装置；液量小时，可用注射器。使用前对其高压灭菌，将滤膜装在注射器的靠针管处，将待过滤的液体装入注射器，推压注射器活塞杆，溶液压出滤膜，从针管压出的溶液就是无菌溶液。

   紫外线和熏蒸灭菌•紫外线灭菌 在接种室、超净台上或接种箱里用紫外灯灭菌。紫外线灭菌是利用辐射因子灭菌，细菌吸收紫外线后，蛋白质和核酸发生结构变化，引起细菌的染色体变异，造成死亡。紫外线的波长为200—300nm，其中以260nm的杀菌能力最强，但是由于紫外线的穿透物质的能力很弱，所以只适于空气和物体表面的灭菌，而且要求距照射物以不超过1.2m为宜。

   熏蒸灭菌 用加热焚烧、氧化等方法，使化学药剂变为气体状态扩散到空气中，以杀死空气和物体表面的微生物。这种方法简便，只需要把消毒的空间关闭紧密即可。常用熏蒸剂是甲醛，熏蒸时，房间关闭紧密，按5—8ml／m3用量，将甲醛置于广口容器中，加5g/m3高锰酸钾氧化挥发。熏蒸时，房间可预先喷湿以加强效果。冰醋酸也可进行加热熏蒸，但效果不如甲醛。化学消毒剂的种类很多，它们使微生物的蛋白质变性，或竞争其酶系统，或降低其表面张力，增加菌体细胞浆膜的通透性，使细胞破裂或溶解。一般说来，温度越高，作用时间越长，杀菌效果越好。另外，由于消毒剂必须溶解于水才能发挥作用，所以要制成水溶状态，如升汞与高锰酸钾。还有消毒剂的浓度一般是浓度越大，杀菌能力越强，但石炭酸和酒精例外。

   喷雾灭菌物体表面可用一些药剂涂擦、喷雾灭菌。如桌面、墙面、双手、植物材料表面等，可用70%的酒精反复涂擦灭菌，l%-2%的来苏儿溶液以及0.25%—1%的新洁尔灭也可以。

   3、 无菌操作

   植物组织培养是一种无菌技术，因此不仅要求整个操作过程，一切用具、材料、培养基、培养室、工作人员的衣物都要无菌，而且要求工作人员在操作过程中要遵守无菌操作的规程，如少有疏忽，都会造成无法挽回的后果，使工作前功尽弃。工作人员在进行无菌操作是要严守以下几点：

   a.入无菌室前，要洗手，去掉指甲中的污物。

   b.入室时要穿上经过消毒的工作服、帽子、口罩和鞋子等。

   c.操作前要用70的酒精擦洗工作人员的手，操作中要经常用酒精擦洗手。不准讲话，亦不准对着操作区呼吸，以免微生物污染材料、培养基和用具。每次重新操作都要把工具在火焰上消毒。

   d.必须在酒精灯火焰处进行操作，如打开瓶口，转接材料。盖瓶盖前应将瓶口在火焰上烧一下，再将盖子也在火焰上烧一下，然后盖上。