植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展

植物耐盐相关基因克隆与转化研究进展    土地盐渍化是限制农作物生长、发育和产量最严重的非生物胁迫之一。对于盐渍化土壤的利用主要采取两种措施，一是用化学或物理方 法改造土壤；二是通过生物技术培育耐盐作物品种。前者不仅耗资巨大，且随着大量化学物质的加入加重了土壤的次生盐渍化，因此培育耐盐 的作物品种就日益重要。国内外学者研究了盐分对植物的伤害、植物耐盐的机理，克隆了一些耐盐相关基因，并通过耐盐相关基因转化，获得 了一些耐盐性提高的转基因植物，展示了诱人的前景。本文从植物耐盐的机理、耐盐相关基因的克隆及转耐盐基因植物等几个方面进行综述， 对该领域的前景进行了展望。

    1 植物耐盐的机理

    盐分对植物胁迫分为渗透胁迫、离子伤害、离子不平衡或营养缺乏三类，渗透胁迫和离子伤害目前被认为是对植物危害的两个主要过程 。植物的耐盐性总的来说可分为形态耐盐和生理耐盐。形态耐盐性是特殊环境下的少数耐盐植物进化出特殊器官泌盐和稀盐，如海滩的红树和 碱蓬属植物。对多数植物来说，则是生理耐盐。本文主要讨论生理性耐盐的研究进展。

    1.1 盐胁迫下渗透机制的调节

    在盐胁迫下，由于外界渗透压较低，植物吸收水分困难，细胞会发生水分亏缺现象。植物为了避免这种伤害，会主动积累一些可溶性物 质，降低细胞的渗透势，从而使水分顺利地进入植物体内，保证植物正常生理活动的进行。渗透调节分为无机渗透调节和有机渗透调节。参与 无机渗透调节的离子主要是Na+、K+、Ca2+和Cl-。赵可夫等研究发现盐生植物的无机渗透剂 以Na+、K+和Cl-为主，而非盐生植物高粱、芦苇等主要以K+和有机渗透物质为主。说明盐生 植物和非盐生植物在渗透调节物质方面的不同。

    植物在逆境中会主动积累一些有机渗透物质，其中小分子化合物有如下几类：第一类是多元醇，如甘油、山梨醇、甘露醇、右旋肌醇甲 醚等；第二类是糖类，如蔗糖、海藻糖等；第三类是氨基酸及其衍生物，如脯氨酸、甘氨酸、甜菜碱等。这些物质对细胞无毒，对代谢过程无 抑制作用，它们的积累在一定范围内可以维持盐胁迫下细胞的正常膨压和代谢功能。这些保护渗透物质在植物抗盐研究中已越来越受重视。

    1.2 盐胁迫改变代谢途径

    在盐胁迫下，一些盐生植物能够通过改变其自身的代谢途径而适应高盐度的生存环境。一些肉质植物，如豆瓣绿属植物、马齿苋科植物 以及禾本科植物冰草等，在盐渍或水分胁迫下可以改变光合碳同化途径，即由C3途径变为CAM途径。CAM植物在夜间开放气孔进行o2 吸收和固定，白天气孔关闭减少蒸腾量。这种转变的机理，赵可夫等认为主要是Cl-活化了细胞中的RUBP羧化酶所导致的。并通过 测量Co2固定和PEP羧化酶活性证实光合作用转变是受盐诱导的。整个光合作用途径的改变是一个十分复杂的过程，涉及的基因很多 ，利用改变植物光合作用途径提高植物耐盐性十分困难。

    1.3 盐胁迫下离子的区域化

    大量的研究表明，植物将吸收的Na+、Cl-等离子积累在液泡中，减少干扰细胞质和叶绿体等的生化代谢过程， 这种作用称为离子的区域化作用。Flowers等实验证明，盐生植物和非盐生植物的细胞对Na+都非常敏感，Na+、 Cl-的区域化分配是植物对盐渍环境适应的结果。由于离子区域化，使得液泡中Na+浓度远远高于细胞质中的浓度。如 高浓度NaCl条件下，生长多代的烟草悬浮细胞系液泡中，积累的NaCl浓度相当高，可达800 mmol/L，而细胞质NaCl的浓度仍保持在100 mmol/L 。研究表明，在NaCl胁迫下，Na+通过质膜进入细胞只有25%左右为主动运输，其余为被动运输，但Na+由细胞质进入 液泡则是一个逆着电化学梯度的主动运输过程。液泡膜转运蛋白活性与Na+、Cl-进入细胞有密切关系。Niu等证明了盐 可以诱导滨藜根和叶子质膜上H+-ATPase基因的表达。Dopont证明当外界环境Na+浓度提高，植物通过 Na+/H+逆向转运蛋白将Na+转运到液泡中，实现区域化，减少细胞质中的Na+浓度，且在滨藜 中Na+/H+逆向转运蛋白活性是被NaCl诱导的。因此，深入研究液泡膜转运蛋白对揭示作物耐盐机理是至关重要的。

    1.4 盐分增加质膜的透性

    盐分能增加质膜的透性，同时当盐胁迫时，植物体内会产生大量的*基，从而引起膜质的过氧化，最终导致膜系统的破坏。80年代以 来，人们对盐分胁迫下植物体内抗氧化防御系统进行了大量研究，并已确定它由一些能清除活性氧的酶系统和抗氧化物质组成，如超氧化物歧 化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸(ASA)等，它们协同作用共同抵抗盐分胁迫诱导的氧化伤害，而单一的抗氧化酶则不足以防御这种氧化胁迫。

    1.5 盐渍条件下拒盐和对离子的选择吸收

    某些盐生植物能通过一些生理机制拒绝或减少对离子的吸收，从而减轻离子所造成的伤害。高粱在1000 mmol/L NaCl中胁迫7天后，其 根和茎部木质部液中Na+比穗轴木质部中Na+要高十几倍，小麦、甜菜、玉米等在盐的胁迫下其根Na+也要 地上部分高3～7倍。说明根具有抑制Na+吸收和向地上运输的机能，对于这种限制移动的控制机制目前人们认为涉及以下过程：(1) 植物体不将Na+吸入根细胞内，即使进入细胞也通过Na+/H+泵再将其排出，就是进入内皮细胞的Na+也同样被排出，且把Na+局限于细胞间隙中；(2)进入根细胞的Na+被吸入液泡，并将其封闭在液泡，阻止Na+向叶片运输；(3)植物体内把进入导管内的Na+向导管外排出，Na+聚积在与导管相邻的薄壁组织细胞中，同时将移动到地上部分的Na+从导管渗进筛管，再将其返送到根部。

    植物通过这种机制保持细胞质有极低渗透势，以抵消液泡渗透势的降低，对减轻高盐对植物损伤有重要作用。

    2 耐盐相关基因的克隆

    2.1 近年来克隆到的盐诱导基因

    近20年来，随着分子生物学的迅速发展，作物耐盐生理生化机制日益明确，使克隆与作物耐盐相关基因成为可能。

    2.2 耐盐相关基因的分类

    根据基因产物的不同，可将现已克隆的基因分为以下几类。

    2.2.1 渗透调节有关的基因　这些基因在正常条件下表达量极低，但是在盐胁迫条件下会大量表达并产生一些小分子有机物，如脯 氨酸、甜菜碱、糖醇等。通过这些小分子物质维持细胞渗透势，提高植物的耐盐性。(1)脯氨酸合成相关基因1990年，Delauney等在大豆中发现 P5CS酶与渗透调节有关，由此提取mRNA，反转录获得cDNA，进一步筛选得到了P5CS基因。到目前为止，P5CS基因已经从紫花苜蓿、豌豆、拟南 芥、水稻等物种中得到克隆和鉴定，不同生物的P5CS基因具有较高的同源性。在紫花苜蓿、豌豆、拟南芥、水稻中的研究表明：盐处理或干旱 条件下P5CS基因转录水平有很大程度的提高，并最终导致了脯氨酸含量的增加。(2)甜菜碱合成相关基因Falkenberg等从菠菜中克隆了BADH的 cDNA片段，并证明甜菜碱的增加与甜菜碱脱氢酶(BADH)的活性有关，BADH基因可增强植物的耐盐性。McCue等从甜菜的λ10cDNA文库中克隆了3 个负责编码BADH的cDNA，发现其氨基酸序列与菠菜的BADH具有83%的同源性。BADH和CMO等基因已应用到耐盐植物基因工程研究中。

    2.2.2 与离子区域化相关的基因 液泡膜上的Na+/H+反转运蛋白直接参与了Na+在液泡中的积 累。王子宁等以水稻Na+/H+反转运蛋白cDNA为探针，从小麦盐胁迫的cDNA文库中筛选和克隆了2个Na+/ H+反转运蛋白基因，分别命名为TaNHX1和TaNHX2。这2个基因与已知的水稻、拟南芥和滨藜中的同类基因 NHX的相似性约为70%。RT-PCR分析表明，小麦苗经400 mmol/L的NaCl处理1小时后TaNHX1基因的转录水平有所提高。Shi等从拟南 芥中克隆了1个Na+/H+反转运蛋白基因SOS1，并证明SOS1基因是Na+和K+在液泡中富集所必需 的，与植物耐盐性直接相关。SOS1基因所编码的蛋白质跨膜结构域与已知的真核生物和细菌的该基因具有显著的同源性。Apes等将1个编码液泡 膜Na+/H+反转运蛋白的基因转入拟南芥，证明其耐盐性显著增强，可在含盐量为200 mmol/L的NaCl土壤中生长。此 外，还有其他关于Na+/H+反转运蛋白基因的报道，目前大家一致认为Na+/H+反转运蛋白基 因对离子的区域化具有重要作用。

    2.2.3 保护酶基因　保护酶(尤其是SOD)是人们研究较早与盐胁迫有关的物质之一，在1989年就已经获得了它的DNA序列，以后克隆 了一系列SOD基因，包括Fe-SOD、Cu/Zn-SOD、Mn-SOD等基因。SOD基因既有单拷贝系列，也有多基因家族。线粒体和叶绿体中的SOD是在核内合 成后再分泌到细胞器中的。多数SOD基因的表达都具有组织特异性，并受许多环境因素的影响。赵风云等的研究表明，水稻的Mn-SOD基因 (sodA1)可由ABA、干旱、盐胁迫诱导，而Fe-SOD基因则由ABA诱导，质体的Cu/Zn-SOD基因(sodCp)由盐胁迫在光下诱导而黑暗条件下则不诱导 。这些现象说明不同的SOD基因表达受不同的因素诱导，因此仅转入1个或1种类型的SOD基因难以提高植物的耐盐能力。

    3 转基因耐盐植物研究进展

    尽管人们已经发现并克隆了许多与耐盐相关的基因，但仅有少量基因被用于转化工作。

    目前获得的一些转基因植物耐盐性虽有提高，但这只是相对于对照植株而言的，转入均是单个基因或相关的两个基因，并没有得到生产 大田能利用的抗盐植株。目前比较一致的观点是：植物的耐盐性是多种生理性状的综合表现，是由位于不同染色体上的多个基因控制的，因此 培育有实践意义的转基因植物可能需要同时转入多个基因。

    3.1 导入编码产生渗透调节物质的酶基因

    刘凤华等利用农杆菌介导法，将BADH基因导入草莓和烟草中获得转基因植株，鉴定表明：转基因植株的耐盐性较对照明显提高，并利用 PCR检测证明耐盐性的提高是由于外源BADH表达的结果。苏金等获得的转基因水稻提高了脯氨酸水平，秧苗对100～150 mmol/L NaCl具有一定 的抗性。除脯氨酸和甘氨酸甜菜碱外，其他渗透调节物质，如甘露醇和山梨醇合成的关键酶1-磷酸甘露醇脱氢酶(mtlD)和6-磷酸山梨醇脱氢酶 (gutD)也相继从大肠杆菌中克隆出来。刘俊君等和刘岩等将这2个基因转入水稻和玉米，分别获得在1.75%NaCl培养基中有一定耐盐能力的转基 因植株。

    3.2 导入与离子区域化效应有关的基因

    Ohta等将Na+/H+反转运蛋白基因转入水稻，在水稻中超表达该基因，发现其木质部蒸腾流中Na+ 的含量明显降低，植物的耐盐性增强，显示可以通过限制Na+在植物细胞中的积累来提高植物的耐盐性。赵风云等从Suaeda Salsa 中克隆到Na+/H+反转运蛋白基因，并证明该基因对植物的耐盐性至关重要。Apes等将一编码液泡Na+/ H+反转运蛋白基因转入拟南芥使其超表达，结果表明，该转基因植株能够在NaCl含量为200 mmol/L的土壤中生长发育，比对照耐 盐性显著提高，可见转入与离子区域化效应有关的基因可显著提高植物的耐盐性。

    4 导入耐盐植物的总DNA

    将耐盐植物的总DNA直接导人大田作物来提高其耐盐性也是近几年来遗传工程研究中的一个重要方面。林栖凤等利用花粉管通道技术， 将海岸耐盐植物红树的DNA导入茄子，获得的转化后代已在海滩上试种，可以用含盐量2.5%的海水浇灌，约90%的植株能开花结果，完成生长 周期，并对其在盐胁迫下的生长情况、蒸腾速率、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶活性以及叶片气孔的电镜观察等进行了研究，实验结果表明，导入红树DNA培育的茄子耐盐能力明显增强，已繁殖到第三代，而对照植株几乎全部死亡。

    综上所述，尽管不同的研究者从诸多方面对植物的耐盐机理作了大量的研究，并已达到了一定的广度和深度，但由于植物耐盐性是一个 受多基因控制的复杂的数量性状，它受植物种类、品种基因型和内部生理生化反应的影响，离实际生产和应用还有相当大的距离。我们虽然了 解了一些盐胁迫条件下作物的反应变化，但我们却不能确定哪一种反应是主要的，利用的可能性有多大，产生的耐盐效应有多大。在转基因植 物方面，虽然得到了一些转基因植物，但如何协调好外源基因与内源基因的关系，控制好基因表达时间和表达量，避免对作物的消极影响等问 题还有待进一步研究。

    但是我们有理由相信随着分子生物学水平和基因操作技术的发展，在不久的将来植物的耐盐性研究会取得重大突破，必可培育出具有实 际应用价值的新品种。

    注：

    (1)参考文献：略；

    (2)文章来源：中国生物工程杂志，2005年25卷第8期；

    (3)作者单位：河北省农林科学院谷子研究所国家谷子改良中心，等。