分子标记在花卉研究中的应用进展

  摘要 DNA分子标记是继形态标记、细胞学标记、生化标记之后发展起来的一种新的更为理想的遗传标记，它促进了植物遗传育种的研究，在花卉研究中也得到了广泛的应用。叙述分子标记的主要类型、原理和特点，以及它在花卉的亲缘关系分析、品种鉴定和分类、遗传多样性、遗传图谱的构建和辅助育种等方面的研究应用概况。

  关键词 分子标记；花卉；应用
  分子标记是一种新型的遗传标记，它不受环境条件和发育时期等因素的影响，可代表物种本身遗传特性，已经成为研究植物遗传育种的有力工具。近年来，国内外许多学者利用分子标记技术对花卉植物开展了不少研究。
  1、分子标记的分类
  分子标记（Molecular marker）是指与特定基因或标记连锁的一段经过扩增并可检测出的DNA序列。DNA分子标记大多以电泳谱带的形式表现，大致可分为两大类。第一类是以分子杂交为核心的DNA分子标记，主要包括限制性片段长度多态性标记（RFLP）；第二类是以聚合酶链式反应（PCR）为核心的DNA分子标记，包括随机扩增多态性DNA标记（RAPD）、简单序列重复标记（SSR ）、重复序列之间长度多态性（ISSR）、扩展片段长度多态性标记（AFLP）等。
  1.1RFLP标记
  RFLP是利用限制性内切酶切割生物体基因组DNA而产生的长短、种类、数目不同的限制性片段的技术，这些具有差异性的DNA片段通过已克隆和标记的DNA片段作为探针进行Southern杂交，然后再放射自显影或非同位素来检测DNA的多态性。RFLP具有技术稳定、重复性好、无表性效应、等位基因之间共显性、非等位基因之间不存在上位效应、标记数量多等优点，是最有效的共显性DNA分子标记；但RFLP分析的探针制备、酶切、转膜、分子杂交、放射自显影等过程需花相当的经费和时间，并且不同物种需制备不同的探针。
  1.2RAPD标记
  RAPD标记是用一系列的单链随机引物（通常为10碱基）对基因组DNA进行PCP扩增，检测特异DNA片段，得到多态性标记的技术。该标记技术的主要优点是速度快、费用低、引物不受物种限制、标记数量多、DNA用量少、对环境污染小等，易于运用；缺点是该标记为显性标记，不能区分纯合和杂合基因型，稳定性较差，且易产生非特异性带。
  1.3AFLP标记
  其基本原理是利用一个对基因组DNA酶切位点少的酶和另一个酶切位点多的酶组合，对基因组DNA进行酶切，再用人工接头与酶切片段的粘性末端连接作为模板，先进行预扩增，之后再进行选择性PCR扩增，最后通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测多态性。AFLP标记的优点是稳定性强、重复性好、多态性高，具有显性或共显性；其缺点是步骤繁琐，对模板反应迟钝，成本高。
  1.4ISSR标记
  ISSR标记根据基因组内广泛存在的微卫星基因序设计单一引物，对基因组DNA进行扩增，扩增的指纹图同时提供基因组内多个位点序列信息。ISSR通常为显性标记，且具有很好的稳定性和多态性。与SSR相比，ISSR-PCR引物不需预先的DNA测序，减少了预备工作，但有些ISSR引物可能在某些基因组DNA中因没有配对区域而无扩增产物；与AFLP相比，ISSR在DNA用量、实验繁琐程度和费用上占优势；与RAPD相比，ISSR揭示的多态性较高，精确度与RFLP相当。
  1.5SSR标记
  在真核生物基因组DNA中广泛存在1~6个核苷酸组成的短的、串联的简单重复序列（SSR），又称为微卫星，SSR两端有一段相对保守的单拷贝DNA序列，根据这段序列设计出特异双引物，对重复区域进行PCR扩增，再经聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增片段的多态性即为SSR标记。由于SSR标记的多态性仅由简单序列重复次数的差异引起的，通常表现为共显性，可鉴别纯合子和杂合子。它的缺点是要克隆足够数量的SSR需要足够的人力、物力和时间，还要针对每类SSR的两端序列设计特异引物，工作量很大。
  2、DNA分子标记在花卉研究中的应用及进展
  2.1种质资源鉴定
  长期以来，各种花卉异地相互引种栽培，杂交及突变，品种名和品种分类十分混乱。因此，对现有花卉品种准确的鉴定和分析十分重要，而分子标记技术为品种鉴定提供了新手段。Ballard[1]等对22个月季的栽培品种进行了RFLP和RAPD分析，鉴定出其中的20个月季品种，结果表明，所有以抗病和感病为亲本的4倍体月季品种表现出较高的遗传多态性，所以抗病和感病的杂交后代适合遗传图谱的建立。
  于燕莉[2]采用RAPD标记方法对金银花中的大毛花金银花、鸡爪花金银花品系进行鉴定，使用35个随机引物进行扩增实验，结果大毛花金银花共扩增DNA谱带24条；鸡爪花金银花共扩增DNA谱带26条，从而区分2个形态极为相似的品系。
  明军[3]等利用梅花AFLP多态位点信息，从178个梅花品种及近缘（品）种构成的群体中，选取了52个品种样品进行了梅花品种资源核心种质的构建。
  2.2亲缘关系及分类研究
  应用分子标记进行植物的分类及亲缘关系分析，可以在分子水平上阐明生物系统演化及分类情况，也直接关系到育种亲本的选配和种质资源的合理有效利用。2000年，周春玲[4]利用AFLP技术，对菊属植物12个分类群的亲缘关系进行分析，结果表明，所选的2个栽培品种滁菊和亳菊可归并为一个品种，该品种与毛华菊、野菊、甘菊亲缘关系相对较近，与紫花野菊的亲缘关系次之，而与小红菊的亲缘关系相对最远。
  王献[5]利用AFLP来研究紫薇的亲缘关系，结果表明，矮生品种间的亲缘关系较近，他们中的粉润和矮生垂枝粉的关系最近；具有优异性状的品种白蝶飞舞和层云积雪的关系较近，红蝶飞舞和蓝色妖姬的关系也较近，而与白密香的关系较远；2个普通的白花品种紫爪银薇和白云映霞的关系较近。
  张俊祥[6]采用AFLP技术对云南省兰属的14个种和3个变种中的38份样本进行了亲缘关系分析，16对AFLP引物扩增的条带聚类结果表明，云南省国兰遗传多样性非常广泛，相同品种间的不同个体扩增出的条带模式相差很大。
  林丽美[7]用RAPD 技术对百合属的4种商品药材百合进行了鉴定。
  刘小莉[8]对报春花属10个种的种间变异进行了ISSR分析，将这10个种明显地聚为了三大类。
  于恒秀[9]利用ISSR引物鉴定芍药栽培品种间的亲缘关系。
  苏雪[10]应用RAPD技术对甘肃栽培的16种紫斑牡丹品种的分类进行了初步研究。
  赵喜华[11]对11种杜鹃属植物进行了RAPD分析，基于DNA分子水平探讨了杜鹃属植物种间的亲缘关系和系统位置。
  2.3遗传多样性研究
  保护生物多样性已成为国际热点问题，其核心内容是遗传多样性的保护。遗传多样性主要是指种内不同居群之间或同一居群不同个体之间的遗传变异的总和。遗传多样性会反映在DNA水平上，因此近年来，DNA分子标记被广泛地应用于植物遗传多样性和遗传结构的研究中。石胜友[12]用8对引物对变叶海棠30个不同的变异类型进行了AFLP分析，从DNA水平上探明了变叶海棠的遗传多样性是变叶海棠与陇东海棠和花叶海棠产生渗入杂交形成的。侯小改[13]利用荧光标记AFLP技术对30份牡丹栽培品种进行了总基因组DNA水平上的多态性检测，结果共获得1 123 条可统计的条带，其中965条呈多态性，多态性带百分率达86%，揭示了牡丹栽培种质丰富的遗传多样性。田晔林[14]用RAPD分子标记技术分析8个一串红品种DNA的多态性，30个引物扩增出162条DNA谱带，119条是多态性的，多态性占73.5%，这表明了RAPD技术是检测一串红品种遗传多样性的有效工具，并为优良品种的遗传改良提供了选配育种亲本的依据。