兰花组织培养新近技术介绍

兰花组织培养新近技术介绍

兰花组织培养的新近技术介绍

 此篇文章用以介绍兰花组培苗在组培瓶内人为环境下的兰花苗生理。近年来，培养基是否需要使用糖份引起了许多争论。日本学者首先提出无糖栽培的论点，认为在强光低糖下植株将成长更好。而原先的高湿与含糖培养基抑制了光合作用。这些争议在此文章中加以讨论。

 在新加坡大学hew博士所编着的”产业相关之热带兰花生理“(physiologyoftropicalorchidsinrelationtotheindustry”此书最后一章为兰花组织培养的新近技术。此章内容不见得完全正确，但也代表着新加坡学术界对于兰花种苗繁殖技术之了解。因此将此篇内容介绍如下：

 一．简介

 由于knudson氐非共生发芽法的发展完成，兰花种子的发芽率广泛地改进，也为兰花组织培养铺下了道路。到目前为主，兰花各部位，例如根部、叶子、花芽、花梗等都可利用以进行繁殖，因此兰花的栽培更快更容易。由于兰花产业的需要，兰花组培苗也成为重要的商品。然而商业化的兰花组培苗生产仍然存在许多问题：幼苗生长缓慢，繁殖倍率低，容易玻璃质化，在健化期根部发育不良，死亡率高。因此由于优良品质的幼苗不容易得到，也限制了兰花产业的扩展。兰花产业需要低成长而且有效的微体繁殖技术以改善兰花幼苗的繁殖倍率与品质。

二．影响兰花组培苗成长的因子

 许多因子影响组培苗幼苗的成长，例如：培养基内碳源、矿物质、养份、荷尔蒙，光合作用有效能量、温度、培养基酸醶值、相对湿度、组培瓶换换气率、与微生物(真菌、细菌)。

 近年来，利用环境控制以改善组培苗栽培情况逐渐受到了重视，可改善的环境因子包括光量、气体环境、温度与相对湿度。作物在自然环境下其气体环境如下：氮78%、氧21%、二氧化碳0.035%，其余为各种气体。对于组培瓶内的气体环境而言，与大气有显著不同。由于组培瓶往往保持气密状态，与外界气体的交换量并不大，用以保持无菌以隔绝外界污染源。由于此种气密要求，造成组培瓶内特殊的气体环境。在商业生产上有许多种组培瓶与不同的瓶盖或瓶塞，组培瓶的材料有玻璃、pc与pe等，用以隔离的瓶盖(塞)则有棉花柱、螺纹瓶盖、铝箔纸、不透明膜等。不同的材料与形状有不同的气体透过率与光线透过率。

 对兰花组培苗生产而言，重要的影响因子如下：

 1.糖份

 在组培瓶内的植株与幼苗等其光合作用能力极低，因此碳平衡很难为正值(光合作用得到的碳源，比呼吸作用消耗的碳源较少)。组培苗生产需要提供额外的碳源(通常为糖)以供成长之用。此结果直接证明兰花组培苗是属于混营光合作用，同时利用空气中的碳源与糖份所提供的碳源。以进行的试验中，显示石斛兰组培苗在三个月后，体内糖份的含量比例与培养基中糖份的比例相同。因此证实兰花组培苗是利用培养基的糖份得到碳源，而无法以自身的光合作用能力得到净碳源。

 培养基中糖份的成份也是影响因子。许多种配方都是以葡萄糖为主要碳源。其它糖份例如葡萄糖与果糖对组培苗的成长影响并不相同。例如虎头兰在蔗糖中成长最佳，胜过其它麦芽糖、葡萄糖与果糖。也有研究显示，虎头兰的原生体在含葡萄糖的培养基内生长受到抑制，然而万代兰培植体在无糖而具有椰子水成份的培养基内生长最佳，显示其对高糖成份的培养基十分敏感，石斛兰与aranda组培苗喜好果糖胜于葡萄糖与蔗糖，如果培养基内蔗糖是唯一的碳源，则被水解成葡萄糖与果糖，葡萄糖先聚集在培养基内，在所有果糖被耗尽后才开始使用。对于石斛兰组织而言，增加糖份浓度则增加其相对生长速率，尤其使用果糖最为显著。虽然果糖证实是最好的碳源，但是在高压高温灭菌作业时其化学特性容易损坏，葡萄糖与蔗糖则无此问题，因此在大量生产时不适合使用。

 在aranda与石斛兰组织的糖份吸收过程中表现为线性动力关系。根据monod关系公式，糖份吸收率与最初糖份浓度有关。研究结果也显示兰花愈伤组织其细胞周围层的糖份吸收率与糖份含量有关，morel氏观察虎头兰的plb也有相同情形。兰花愈伤组织的糖份吸收率由其表面积对体积的比值决定。在aranda愈伤组织的研究中，显示在含有葡萄糖的培养基内，葡萄糖的吸收率相当高。由其内部糖度比较结果，显示葡萄糖的吸收率是其干物质成长率的10-100倍。由此显示葡萄糖在细胞内的累积率比其应用于成长的比率更多。

 兰花组织在不同成长阶段对于不同的糖类有不同的亲和性，因此要定出标准配方十分困难。培养基具有低糖量可避免细胞内累积过多的糖份。因此如果使用低糖份的连续液态培养基对于组培苗应该有帮助。

 培养基内的糖份含量协助细菌与真菌的快速成长。因此组培瓶必须气密与无菌以避免外在的污染源。在组培产业上，污染问题对组培苗生产有极大的影响。

 2.二氧化碳

 兰花组培作业通常在密闭系统内进行，气体交换率非常低，光周期时组培瓶内浓度降到极低。在欧洲的温室，冬天施加用以增强作物的光合作用。近十年来，日本与韩国研究人员针对组培苗栽培，一直持续进行以增加方式以促进生长的研究。在组培苗生长过程时持续的供应，使维持足够浓度，用以确保小植株生长时不受到不足的影响。

 在日本学者kozai等人的研究，认为对多数非兰科作物，增加可促进生长。虎头兰以花宝为培养基材料，证实增加可促使兰花成长。而组培苗光合作用曲线为，光合作用能量与温度的函数。

 对cam作物而言，其光合作用模式因个体的发展而改变。cam兰花的小幼苗主要以反应为主，仅有低的cam反应。在兰株逐渐成长后，随着组培苗栽培时间，cam型光合作用逐渐增加。由于cam作物中其反应并不长，因此以增加方式以促进组培苗成长的效果并不显著。在mokarawhite组培苗的无糖栽培研究中，以三种处理进行比较：﹙1﹚1％、80，﹙2﹚1％，200，﹙3﹚10％，200。结果显示第﹙2﹚种处理有最大的干物重，显著地优于第﹙3﹚种处理。

 3.乙烯

 兰花组培苗在密闭的环境下成长，与外在环境的气体交换率极低，因此组培苗成长时影响了组培瓶内在微气候。组培瓶顶部空间乙烯累积时，其与氧气浓度迅速下降。乙烯的累积量除了受到植物成长时间的影响，其它影响因子包括使用培养基的种类与组培瓶的气密性。乙烯对植物组织的影响有利与有弊。乙烯浓度的负面影响包括阻碍植物成长与促进老化。为了避免乙烯浓度过高，可使用silverthiosulphate或silvernitrate，加于培养基内以减少乙烯产生。另一种方法是以通风装置以增加气体扩散能力以促进小苗生长。

 已有研究显示增加可以阻碍乙烯的作用。由于与乙烯的分子十分类似，因此可做为与乙烯作用的竞争抑制剂。然而对整体的成长而言，以与乙烯对抗并不完全有利。

 4.氮源

 有许多研究显示石斛兰的组织与组培苗，对于离子的吸收胜于n离子。嘉德利亚兰体胚在发芽与生长初期无法吸收利用n离子，而在60天后才有能力使用氮离子。到现在为主，兰花组培苗为何无法利用氮离子？此原因尚未清楚。

 5.光强度

 在密闭状况的组培容器内，光强度通常为60–65。以白色灯管而言，约为4800–5100lux。在进行施加栽培作业时，光量可增加至80-200。有许多研究显示在健化与大量繁殖阶段增加浓度与增大光量可促进生长。

 6.光照方向

 光线方向对兰花成长的影响并无详细报导。日本研究人员曾经试验以侧光促进组培苗成长并控制植株高度。此种方式最大的优点是采用方型ga-7组培瓶，瓶子可以采取推叠方式以节省空间。灯管置于组培瓶侧面，因此组培苗照射的光线不受推叠影响。日本研究人员宣称对马铃薯幼苗而言，侧面照明的干物种与叶面积比传统对照值高1.8倍，底部的叶子较大，植株较短。日本另一种新近技术为利用光纤或led进行给光。

 7.其它因子

 在密闭的组培瓶内，内部相对湿度为70–90％。当此种组培苗移植至外界，因为大气较低相对湿度引起健化问题。组培瓶内的组培苗通常有较薄的角质层，气孔发育不全，在移植至自然界后很难控制体内水分，因此容易脱水而死。面对此种高湿问题，可利用气体透过膜加以改善。

 氧气对于兰花组培苗的影响并未有研究报告。瓶内增加浓度即相对减少氧气浓度。减少氧气浓度也可阻碍真菌与细菌的发展。氧气浓度如果太低，呼吸作用也会受阻，这可能是减低氧气浓度对组培苗带来的好处。

【米兰栽培养护要点】

 三．兰花组培技术的改进

 日人kozai教授认为组培苗体外（invitro）栽培时，具有叶绿素的幼苗其净光合作用速率低，主要原因是来自组培瓶内二氧化碳固定作业时，瓶内二氧化碳浓度太低。传统栽培方法中，培养基内部的糖份会抑制组培苗自营光合作用。组培苗由于光合作用能力低，因此无法提供正值的碳平衡，因此需要补充糖份以做为碳源，而组培苗也因此进行混营光合作用。由于混营光合作用的结果，组培苗在健化期生长缓慢，死亡率高。近年研究证实具有叶绿素的组培苗具有光合作用能力，在自营光合作用情况下与适当的环境情况下，组培苗能够有较高的成长率。组培苗传统有糖栽培方法的缺点如下所示：

 1.培养基内所含糖份容易引起微生物污染

 2.由于具有糖份，光能量对促进生长并不有效

 3.必须使用小型且气密的容器以降低污染损失

 4.组培瓶内空气处于饱和状态

 5.与乙烯浓度可能增减至不利作物的程度

 6.经常需要使用荷尔蒙以促进生长

 7.不正常的环境容易导致生理或型态异常，减缓生长，增加变异程度

 8.在健化期死亡率高，良品比例低

 9.很难使用计算机与机械手臂进行组培自动化作业

 日本研究者对上述问题的改善方式如下：

 1.采用透气膜

 由于组培苗的生长受到组培瓶内气体环境的影响，此种气体环境可以增大通风量（气体交换率）的技术加以改进。因此利用换气以排除乙烯并引入外界的二氧化碳。透气膜必须有高度透光性，低水蒸气穿透性，不释放化学物质，因此不影响组培苗的正常生长与发育。而且透气膜必须能够阻绝细菌与真菌的进入。

 常用的透气膜技术是在组培瓶周壁上穿孔，再贴上可耐高压高温杀菌的透气膜（通常开口为0.5）。

 2.提供

 有好多种方法可以提高外界以促进光合作用。第一种方法将具有透气膜的组培瓶放入生长箱内，生长箱再施给高浓度。另一种方法系以空气邦浦通气方式直接将高浓度以高压加入组培瓶内，但是此种方法容易造成干燥作用，使瓶内培养基失去水分变异。因此许多作物反而生长不良。

 3.改变培养基

 兰花分生组织可在固体或液体培养基内栽培。介质再利用通风作业以促进生长。因此曾采用微孔pe膜以作为载具，将嘉德利亚兰与epidendrum种子加以播种，也可用以繁殖嘉德利亚兰、虎头兰与石斛兰的原生质，也曾用以栽培嘉德利亚兰的幼苗。此种膜为亲水性，在栽培兰花组织时证实有显著帮助，原因在于可以通风。日本研究者曾经将蝴蝶兰幼株栽培于rockwool介质，用以取代培养基，发现根系的发展优于传统培养基。

 四．增加的优点

 组培苗的品质指针可由瓶苗移植到自然界后可存活的比例加以评估。组培苗不利成长的现象可由增加技术加以改善。其附加利益如下:

 1.减少玻璃质化

 在组培苗栽培由于玻璃质化引起了生理的异常。玻璃质化的原因包括相对湿度太高，提供过量的矿物质与碳源，植物荷尔蒙太高，光量太低等。组培苗的茎部变细，变得透明化，叶子过长，根系发育不良，气孔发育不全等。叶片发育不正常，叶绿素不足。因此在健化过程存活率极低。组培瓶内相对湿度通常为90-100％，因此使组培苗产生更多的乙烯，而且使气孔发育不全。

 日本学者kozai以增加技术进行菊花组培苗试验，由于大量通气。因此瓶内相对湿度降低，组培苗比传统栽培方式之苗株有更厚的表层腊质，更适当的气孔发育，养份吸收更多。

 2.改善发根状态

 传统组培苗生产，发根阶段的成本通常占所有成本的35％－75％。日本学者研究显示在增加的栽培作业中，发现根系发育更好，因此减少在田间健化的所需时间。

 此篇文章的内容几乎来自新加坡与日本学者对于组培苗的研究论文。其中“无糖栽培技术”与“二氧化碳添加技术”是其强调重点。

 组培苗无糖栽培技术在日本学界已进行十余年。对于组培苗生产是否有用？无论日本学界发表多少篇研究，日本商业化生产组培苗的公司并无一家采用，更不用提及其它国家。无糖栽培与施用技术至今仍然停留在日本与韩国的大学研究室。因为许多论文只有比较在不同处理下，各组培苗的最后叶面积与干物重，对于组培苗成长过程无法观察，更谈不上对组培瓶内部微气候的了解。以个人研究室之研究经验看日本研究者对组培苗的研究结果，可以以“瞎子摸像”之故事加以比喻。如果无法看到组培苗生长的全部现象，则容易以一己之见自立学说，而其学说与实际并不相同，当然不能协助产业。此种学术研究与产业脱节的现象在*农业界也屡见不鲜。

 组培苗的生理研究都牵涉到以下问题:

 1.培养基的糖份如何被组培苗吸收利用?

 2.组培苗如何在组培瓶内进行光合作用?

 3.组培瓶内微气候如何变化?

 4.组培苗如何同时进行碳源固定与养份吸收？

 要了解各种栽培条件对于组培苗的影响，一定要进行组培苗的生理感测。中兴大学生物系统工程研究室在组培苗的研究中即自“感测”与“建模”开始先开发各种传感器与感测技术，用以量测瓶内微气候：包括温度、光量、相对湿度、氧气浓度与二氧化碳浓度。再推衍组培苗光合作用、呼吸作用与蒸散作用等三项生理作用的数学模式。而以模式计算结果与量测结果加以验证后，以此建立组培苗栽培的最佳作业条件。这些研究结果已由组培业者应用于实际的生产线。

 此篇文章系以由hew教授所着书本第九章的内容说明日本与新加坡学者对组培技术的见解。美国与德国的研究界则对“无糖栽培”、“添加”、“进行通风”等技术进行组培苗生长比较，得到反而是负面的结果。在生技产业中，研究论文与产业技术都有一段差距，主要的原因在于研究人员只考虑单一因子的影响而忽略了其它因子的重要性，但是组培苗的成长需求各因子相互配合。许多研究论文的研究结果并非一无是事，只是无法说明完整的事实。因此如何自一篇篇学术论文中汰芜存菁，在于每个人对于组培苗研究领域功力的高低。

 生物系统工程研究室在组培苗产业相关技术的研究结果已在此网站上加以介绍，详细的技术内容因为涉及到国内兰业产业的发展因此无法公开于网站。唯有以研习班或是现场讨论方式，与组培业者共同解决组培苗栽培问题，这也是组培产业与研究人员互动的另一种特殊方式。