昆明市马铃薯茎尖分生组织培养脱毒技术规程

昆明市马铃薯茎尖分生组织培养脱毒技术规程

马铃薯病毒的危害已成为当前马铃薯生产上的严重问题，造成马铃薯生长受到抑制、形态畸变、产生叶面皱缩、花叶、杂斑等许多症状，导致薯块品质变劣，产量大幅度下降，最终失去利用价值，这就是通常说的马铃薯退化现象。马铃薯茎尖分生组织培养是解决马铃薯退化的最有效的方法，它是根据病毒在植株体内分布不均匀性及越靠近新生组织部位病毒含量越少的原理，结合使用钝化病毒的热处理方法，通过剥取茎尖分生组织进行培养获得脱毒植株。目前除了一些类病毒外绝大多数植物病毒几乎都能通过茎尖分生组织培养的方法脱除。这一技术具有周期短、效率高、能与组织培养快速繁殖相结合等特点，在马铃薯上得到普遍应用。昆明市农科院生物所组培室长期至力于马铃薯优良品种的脱毒复壮工作，从2005年底至今已成功对30多份马铃薯优良品种进行病毒脱除，使其恢复了原有的优良性壮，并推广到省内和市内的各马铃薯主栽区，为马铃薯产业的发展做出了一定的贡献。我们所采用的马铃薯茎尖脱毒技术的操作过程归纳如下：

1．材料的选择

实践证明，同一个品种个体之间在产量上或病毒感染程度上都有很大的差异。进行茎尖分生组织培养之前，应于生育期，对准备进行脱毒复壮的马铃薯品种或材料，进行田间株选和薯块选择，选择具有该品种典型特性、生长健壮的单株，结合产量情况，选择高产、大薯率高、无病斑的单株作为茎尖脱毒的基础材料，以提高脱毒效果。由于马铃薯纺锤块茎类病毒病在目前用植物茎尖分生组织方法很难脱掉，在进行茎尖剥离脱毒前，应先对入选的块茎进行pstv检测，淘汰带有pstv的薯块，以免前功尽弃。

2．热处理

为提高脱毒效果，脱毒材料在进行茎尖组织剥取前，应进行材料的热处理，以钝化病毒的活性，消除马铃薯卷叶病毒，提高脱毒效果。把入选的马铃薯块茎进行打破休眠和催芽处理，当薯块顶芽生长至1厘米后，转入光照培养箱内，以每天12小时光照，照度3000lx，37℃的高温处理6-8周。

3．取材和消毒

剪取经过热处理后发芽块茎上2－3厘米长的芽若干个，用软毛刷轻轻逐个刷洗后放于烧杯中，用纱布封口，放于自来水下冲洗半小时，然后在超净工作台进行严格消毒：先用75%的酒精浸15秒，无菌水冲洗2次；再用0.1%的升汞浸泡8-10分钟，无菌水冲洗5-8次，每次3-5分钟，冲洗完后放在灭过菌的培养瓶内待用。

4．剥离茎尖和接种

在超净工作台上，将消毒过的芽置于40x的解剖镜下，一手用一把眼科镊子将芽按住，一手用灭过菌的解剖针将叶片一层一层仔细剥掉，直至露出圆亮的生长点，用锋利的无菌解剖针小心切取0.3毫米以下的带1-2个叶原基的茎尖，随即将茎尖接种于已准备好的马铃薯茎尖培养基上，以切面接触琼脂。要注意确保所切下的茎尖不能与已剥去部分、解剖镜台或持芽的镊子接触。另外，在剥离过程中，必须注意使茎尖暴露的时间越短越好，因为超净台的气流和酒精灯发出的热都会使茎尖迅速变干。所以在选择解剖镜的灯源时，尽量以冷光灯为好，同时在材料下垫一张灭过菌的湿滤纸保湿，每剥一个茎尖后，换一张无菌湿滤纸。

由于块茎萌发的芽的数量有限，加上剥离过程中难免损伤到茎尖，导致可剥离的茎尖量少、成苗的机率小，易造成优良品种和材料的丢失。经过多年的实践，我们总结出一种行之有效的方法：取经严格消毒过的块茎芽接种在不含任何激素的马铃薯快繁培养基上，于25℃的温度，每天光照12小时的培养室培养，3-4周后，待芽长成含4-5片叶子的小苗时，剪切成单节段，转接于同样的无激素ms培养基上，培养成苗。同样方法扩繁1-2个周期，等苗达一定数量后，再直接用这些苗来剥离茎尖，既能保证材料不丢失，又能增加茎尖的数量，从而能增加成苗的机率。

5．茎尖培养与病毒检测

5．1 培养基

选择合适的培养基是茎尖培养成功与否的关键，根据我们的经验，以ms+ga30.2毫克/升+6-ba0.5毫克/升+naa0.05+肌醇100毫克/升+d－泛酸钙0.2毫克/升+食用白糖3%+琼脂0.6%，ph5.8，为比较好的培养基组合。

5．2 培养

茎尖培养对培养器皿无特殊要求，一般以150毫升三角瓶或250毫升罐头瓶，每瓶装40毫升培养基，为节约培养基，每瓶接种2-3个茎尖，均匀分布于培养基表面。接种好的茎尖放在培养室内培养，温度18-25℃，光照2000-3000lx，每天光照12小时。培养两周后，培养瓶内的茎尖生长点便明显变大变绿，30-40天即可看到明显伸长的小茎，叶原基形成可见的小叶，这时可转入无激素的ms培养基中，小苗继续生长，并形成根系，4-5个月后即可发育成3-4个叶片的小植株，将其按单节切段，进行扩繁，成苗后，用于病毒检测。 　　5．3病毒检测 　　由茎尖分生组织培养获得的小苗，经第一次扩繁后要对其进行严格的病毒检测，以确定材料的脱毒情况。一般采用指示植物鉴定法、电镜检测法或抗血清鉴定法，经病毒检测后，确认是不带病毒的株系，才能进一步利用，对继续带病毒的株系应淘汰或进行再次脱毒。