植物组织培养基础理论

植物组织培养基础理论

培养基是人工配制的，满足不同材料生长，繁殖或积累代谢产物的营养物质。在离体培养条件下，不同种类植物对营养的要求不同，甚至同一种植物不同部位的组织以及不同培养阶段对营养要求也不相同。筛选合适的培养基是植物组织培养极其重要的内容，是决定成败的关键因素之一。

 大多数植物组织培养基的主要成分是无机营养物质（大量营养元素和微量营养元素）、碳源、有机添加物、植物生长调节剂和凝胶剂。一些组织可以生长在简单的培养基上，这些培养基只含无机盐和可利用的碳源（蔗糖），但大多数组织必须在培养基中添加维生素、氨基酸和生长物质，而且经常还将一些复合的营养物质加入到培养基中，这种由“化学定义”的化合物组成的培养基称为“合成”培养基。

 人们已设计了许多培养基用于特殊组织和器官的培养。

 怀特培养基是最早的植物组织培养基之一，最初作为根培养的培养基。为了诱导培养组织器官发生和再生植株，广泛使用含有大量无机盐成分的ms（murashige和skoog，1962）和ls(linsmaier和skoog，1965)培养基。原本为细胞悬液或愈伤组织培养而设计的b5培养基，经过改良后，被证实有利于原生质体培养。同时，b5培养基也被用于诱导原生质体再生植株。尽管nitshch(1969)为花药培养设计的培养基仍然使用频繁，但另一个称为n6的培养基，专门用于禾谷类花药培养和其他组织培养。类似的，n6培养基越来越多地用于大豆、红三叶草和其他豆科植物的培养。该培养基营养成分促进胚性细胞和原生质体再生细胞快速生长。使用这些培养基成功的原因很可能是营养元素的比例和浓度基本上满足不同培养体系中细胞或组织生长和分化的最适需要。

 植物组织培养基中无机和有机成分的浓度用质量浓度（mg/l或ppm，但现在习惯用mg/l）或物质的量浓度(mol/l)表示。按照国际植物生理学协会的推荐，应该用mol/l表示大量营养元素和有机营养成分浓度，用μmol/l表示微量营养元素、激素、维生素和有机成分浓度。用物质的量浓度的优点是，每一种化合物每一摩尔的分子数是常数，所以按照特定培养基配方配制培养基时，无论无机盐化合物的水分子数为多少，原物质的量浓度都可以使用。但是，用质量浓度来表示浓度的话，就不能不考虑无机盐化合物的水分子数目了。

 1、水分

 水分是植物体的主要组成部分，也是一切代谢过程的介质和溶媒，在植物生命活动过程中不可缺少。配制培养基母液时要用蒸馏水或纯水，以保持母液及培养基成分的精确性，防止储藏过程中发霉变质。研究培养基配方时尽量用蒸馏水，以防成分的变化引起不良效果。而在大规模工厂化生产时，为了降低生产成本，常用自来水代替蒸馏水。如自来水中含有大量的钙、镁、氯和其他离子，最好将自来水煮沸，经过冷却沉淀后再使用。

  2、无机营养成分

 除了碳（c）、氢（h）、氧（o）外，已知还有12种元素对植物的生长是必需的。根据植物生长需求量的多少将这些无机营养元素分为大量元素和微量元素两类。

 各种矿质元素（盐）为植物生命活动提供必需的大量营养元素和微量元素。需要量大于0.5mmol/l浓度的元素称为大量元素,小于0.5mmol/l称为微量元素。当无机盐溶于水中时，无机盐发生分解和电离作用。培养基中的一种离子可能由几种盐分解而来。如ms培养基中的no3-离子由nh4no3和kno3提供，k+离子由kno3和kh2po4提供。因此，计算总离子浓度有利于比较不同的培养基，探讨特定组织或培养体系的适宜培养基。

    （1）大量元素

 指培养基中浓度大于0.5mmol/l的元素，包括氮（n）、磷（p）、钾（k）、钙（ca）、镁（mg）、硫（s）。

 它们以无机盐的形式存在于各种培养基中，对植物细胞和组织生长都是必不可少的。培养基至少应含有25mmol/l的no3-和k+。不过，如果以硝酸盐和氨盐（2~20mmol/l）或其他任何还原性氮作为培养基的氮源，都能获得非常好的饿实验结果。如果只使用铵盐作为唯一的氮源，则需要加入一种或多种三羧酸（tca）循环的羧酸（如柠檬酸盐、琥珀酸盐或苹果酸盐），以便减轻培养基中氮浓度超过8mmol/l产生的毒害。当硝酸银和氨离子共同存在于培养基中时，氨离子更迅速的被利用。另一些大量元素，如ca、p、s和mg，在其他营养需要满足下他们的适宜浓度为1~3mmol/l。

 氮参与蛋白质、核酸、酶、叶绿素、维生素、磷脂、生物碱等物质构成，是生命不可缺少的物质。缺氮时，老叶先发黄；氮过量，枝叶会过度茂盛。氮主要以销态氮和铵态氮两种形式被使用，常使用的含氮物质有kno3、nh4no3、(nh4)2so4等，大多数培养基将销态氮和铵态氮两者混合使用，以调节培养基的离子平衡。

 磷参与磷脂、核算、酶及微生物等多种生理活性物质构成，在植物碳水化合物的运输和代谢中起着极其重要的作用，磷直接参与呼吸作用和发酵过程，与光合作用也有直接关系。缺磷时植株生长缓慢，老叶暗紫色。磷常由kh2po4、nah2po4提供。

 钾对碳水化合物合成、转移以及氮素代谢等有密切关系。钾增加时，蛋白质合成增加，维管束、纤维组织发达，对胚的分化有促进作用。缺钾时叶尖、叶缘枯焦，叶片呈皱曲状，老叶发黄或火烧状。常用的含钾化合物有kcl、kno3、kh2po4等。

 镁是叶绿素的组成成分，又是激酶的活化剂，缺镁时叶片边缘及*部分失绿而变白，镁常以mgso4来提供。

 钙是构成细胞壁的一种成分，钙对细胞分裂、保护膜不受破坏有显著作用。缺钙时嫩叶失绿，叶缘向上卷曲，出现白色条纹。常以cacl2提供。

 （2）微量元素

 指培养基中浓度小于0.5mmol/l的元素，有铁（fe）、硼（b）、锰（mn）、铜（cu）、钼（mo）、钴（co）等.微量元素也是植物组织培养中不可缺少的元素，缺少这些物质会导致生长、发育异常。其中铁似乎更重要，因为配制培养基中常使用螯合铁和螯合锌。酒石酸铁和柠檬酸铁难溶解，经常在培养基中发生沉淀。使用乙二胺四乙酸（edta）-铁螯合物代替柠檬酸铁，特别是胚胎诱导中，可以克服沉淀产生的问题。

 微量元素是许多酶和辅酶的重要组成成分，生理作用主要体现在酶的催化功能和细胞分化、维持细胞的完整机能等方面。如铁是多种氧化酶和叶绿素的重要成分，而且是维持叶绿体功能所必需的；铜有促进离体根生长的作用；钼是合成活跃的硝酸还原酶所必不可少的元素，也是固氮酶的组成部分，还有防止叶绿素受破坏的作用；锌是酶的组成成分，也有防止叶绿素破坏的作用；锰与植物呼吸作用、光合作用有关；硼与糖的运输、蛋白质的合成有关。

 当某些微量元素供应不足时，植物表现出一定的缺素症状。如缺铁，绿叶变黄，进而发白；缺锰，叶片上出现缺绿斑点或条纹；缺锌，叶片发黄，或出现白斑，叶子小；缺硼，叶失绿，叶缘向上卷曲，顶芽死亡；缺钴叶片失绿而卷曲，整个叶片向上弯曲凋枯。

 3、碳源和能源

 植物组织培养最适合的碳源是蔗糖。葡萄糖同样有利于植物组织生长，而果糖产生的效力较低。培养基高压灭菌时，蔗糖转变为葡萄糖和果糖。在培养过程中，先利用葡萄糖，然后利用果糖。

 植物细胞和组织在培养基中缺乏自养能力，因此，需要外源碳源提供能量。在培养期间的特殊条件下，即使组织开始变绿或产生绿色色素，培养组织生产的碳源也不能自给自足。将外源碳源加入到培养基后，可增强细胞增殖和绿茎再生能力。

 除此之外，糖类的添加还有调节培养基渗透压的作用。

 在培养基高压灭菌过程中，部分蔗糖发生水解。但是，培养物在高压灭菌的蔗糖培养基上生长较好，而在过滤消毒的蔗糖培养基上次之。从这个结果可以推论出，高压灭菌使蔗糖水解成葡萄糖和果糖，有利于细胞生长和分化。

 在大规模生产中，蔗糖价格太贵，常用食用绵白糖、白砂糖代替蔗糖，但在不同的植物种类上，其使用的可行性及其浓度范围需要做小规模的生产性实验。

 4、有机营养成分

 （1）维生素

 植物合成的内源维生素，在各种代谢过程中起着催化剂的作用。当植物细胞和组织离体生长时，也能合成一些必需的维生素，但不能达到植物生长的最佳需要量。因此，必须在培养基中添加必需的维生素和氨基酸，使植物组织健壮生长。比较常用的维生素是盐酸硫胺素（vb1）、盐酸吡哆醇（vb6）、烟酸（vb3）、肌醇等，盐酸硫胺素是所有细胞和组织必需的基本维生素。烟酸和盐酸吡哆醇常添加到培养基中，但对许多植物的细胞可能不是必需的。其他维生素如生物素（vh）、叶酸、抗坏血酸（vc）、泛酸钙、维生素e（生育酚）、核黄素和对氨基苯甲酸也常被使用。氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对外植体的生长以及不定芽、不定胚的分化起促进作用。抗坏血酸还有防止组织褐变的作用。

 （2）氨基酸

 氨基酸是蛋白质的组成成分，也是一种有机氮化合物。常用的氨基酸有甘氨酸、谷氨酸、精氨酸、半胱氨酸以及多种氨基酸的混合物，如水解酪蛋白（ch）、水解乳蛋白（lh）等。氨基酸类物质不仅为培养物提供有机氮源，同时也对植物体的生长及不定芽、不定胚的分化起促进作用。与无机氮不同，氨基酸能被植物细胞很快吸收。

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  5、植物生长调节剂

 （1）生长素

 生长素由茎尖合成，沿植物体向下运输，常用的生长素有吲哚乙酸（iaa）、吲哚丁酸（iba）、萘乙酸（naa）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-d）和萘氧乙酸（noa）等。iaa和iba见光易分解，故应置于棕色瓶中，iaa在高温灭菌时会受到破坏，最好采用过滤除菌方法。

 在植物组织培养中，生长素的主要作用有：①诱导愈伤组织的产生，促进细胞脱分化；②促进细胞的伸长；③促进生根；④2，4-d会诱导某些植物不定胚的形成。

 生长素通常溶解于乙醇或低浓度的氢氧化钠溶液中。

 （2）细胞分裂素

 细胞分裂素由根尖合成，沿植物体向上运输。细胞分裂素是腺嘌呤的衍生物。常用的细胞分裂素有6-苄氨基嘌呤（6-ba）、激动素（kt）、玉米素（zt）、2-异戊烯腺嘌呤（2-ip）、噻苯隆（tdz）、氯苯脲（cppu）等。

 在植物组织培养中，细胞分裂素的主要作用有：①促进细胞分裂和扩大，使茎增粗，而抑制茎伸长；②诱导芽的分化，促进侧芽萌发生长；③减少叶绿素的分解，抑制顶端优势，延缓离体组织或器官的衰老，有保鲜的效果；④对根的生长一般起抑制作用。

 在植物组织培养时，细胞分裂素/生长素的比值控制器官发育模式，若增加生长素浓度，有利于根的形成；增加细胞分裂素浓度则促进芽的分化。

 （3）赤霉素（ga）和脱落酸（aba）

 这2种植物生长调节剂不常用于组织培养中。一些植物需要赤霉素和脱落酸增强生长，而在另一些植物中需要它们抑制生长。ga3是20多种赤霉素中最常用的，ga3能促进低密度培养细胞的生长，增加愈伤组织生长，诱导矮化或发育迟缓的植物伸长生长。ga3最好现配现用，过滤灭菌后加入到培养基中。

 根据植物种类不同，脱落酸在培养基中刺激或抑制愈伤组织生长。据报道，脱落酸有利于胚胎培养。脱落酸还有抑制生长、促进休眠的作用，在植物种质资源超低温冷冻保存时，可以用来促使植物停止生长和抗寒力的形成，从而保证冷冻保存的顺利进行。

 6、其它物质

 （1）天然有机添加物

 培养基经常添加各种成分不确定的天然有机提取物。常用的有椰子汁（cm）、酵母提取物（ye）、番茄汁、香蕉泥和土豆汁等。

 由于天然有机物质成分复杂，常因品种、产地和成熟等因素而变化，实验的重复性比较差。另外，有些天然有机物质还会因高压灭菌而变性，从而失去效果，这时应该采取过滤的方法进行灭菌。

 （2）活性炭（ac）

 培养基中添加活性炭的主要作用是利用其吸附能力，减少一些有害物质的影响，例如防止酚类物质引起组织褐变死亡；活性炭使培养基变黑，有利于某些植物生根；活性炭还可降低玻璃化苗的产生频率，对防止产生玻璃苗有良好作用。

 但活性炭对物质吸附无选择性，既吸附有害物质，也吸附必需的营养物质，如在非洲菊继代培养过程中，相同的继代培养基，添加2.0mg/l活性炭后，其增殖系数大大降低，因此使用时应慎重考虑，不能过量，一般用量为1~5mg/l。高压灭菌前加入活性炭会降低培养基的ph值，使琼脂不易凝固，因此要加大琼脂用量。

 （3）抗生素

 培养基中添加抗生素可防止菌类污染，减少培养材料损失。低浓度链霉素和卡那霉素能有效的控制微生物的系统侵染。常用的抗生素有青霉素、链霉素、庆大霉素、四环素、氯霉素、卡那霉素等，用量一般为5~20mg/l。大部分抗生素需要过滤灭菌。

 （4）硝酸银

 离体培养基中植物组织会产生和散发乙烯，而乙烯在培养容器中的积累会影响培养物的生长和分化，严重时甚至导致培养物的衰老和落叶。硝酸银中的ag+通过竞争性地结合于细胞膜上的乙烯受体蛋白，从而可起到抑制乙烯活性的作用。硝酸盐的使用浓度一般为1~100mg/l，使用前过滤除菌。

 （5）抗氧化物

 植物组织在切割时会溢泌一些酚类物质，渗出细胞外就造成自身中毒，使培养材料生长停顿，失去分化能力，最终变褐死亡。在木本尤其是热带木本及少数草本植物中较为严重。常用的抗酚类氧化剂有半胱氨酸、聚依稀吡咯烷酮及抗坏血酸，可用浓度为50~200mg/l的抗酚类氧化剂洗涤刚切割的外植体伤口表面，或过滤除菌后加入固体培养基的表层。

 （6）凝固剂

 由于在静止液体培养中，组织或细胞浸没在培养基中，发生缺氧死亡。在配制固体培养基时，需要使用凝固剂。最常用的凝固剂是琼脂，琼脂是一种来源于海藻的多聚糖，比其他胶凝剂的优点多：第一，琼脂凝胶不与培养基组分起反应；其次，它们不会被植物细胞分泌的各种酶降解，在所控制的培养温度中保持稳定。琼脂本身并不提供任何营养，它是一种高分子的碳水化合物，在90℃以上热水中溶解成为溶胶，冷却至40℃可凝固为固体凝胶。

 琼脂有粉状和条状之分，现在绝大多数使用的是琼脂粉。琼脂的使用浓度应适当，如果浓度过高，会使培养基变得很硬，营养物质难以扩散，不利于植物体吸收营养；若浓度过低，凝固性差。琼脂的凝固能力还与高压灭菌时的温度、时间、ph值等因素有关。

 另一种凝固剂是卡拉胶，也是一种海藻提取物，价格比琼脂便宜，但有些植物培养效果不理想。