石斛兰无菌播种与组织培养

  无菌播种

  石斛兰的种子极为细小，胚胎发育不完全，所谓的胚实际上就是一团未分化的胚细胞，且无胚乳组织，在自然状态下发芽率极低，只有与兰菌共生才能少量发芽，成苗更难，因此不能像其他植物一样在大田或苗床上播种，只有在无菌的补充营养的人工培养基上，促进其萌发成苗。

  1、种子的采收与播种

  应用于无菌播种的石斛兰的种子的果实以刚成熟但尚未开裂时效果较好，未成熟时能发芽，但发芽率略低，而如果果实成熟开裂，种子难以收集与消毒，且种子发芽力降低。种子采收后宜即采即播，否则会影响发芽率，未来得及播时，应用密封的塑料袋装好放入4℃的冰箱中保存，但时间不宜过久，否则易长霉或降低发芽率。

在进行无菌播种操作时，可采用如下步骤：

  （1）无菌播种一般在超净工作台上进行，在操作前准备好所有的药剂和工具，保持超净工作台的无菌状态。

  （2）石斛兰果实一般在成熟未开裂前采收，对于杂交不亲和的种类可采取未成熟的果实，采收后先将果实表面的脏物冲洗干净，将上下两端切除。

  （3）将果实置于75%乙醇中浸10～15秒，再在5%~10%漂白粉溶液中、或0.1%的升汞溶液中、或3%的双氧水，或5%的安替福民溶液中浸5～20分钟，以无菌水冲洗数遍。

  （4）用无菌滤纸擦干后，再用解剖刀切开果实，里面的黄色粉状物即为石斛兰种子。

  （5）用镊子轻轻将种子取出播于培养基中。

  （6）播种后稍加摇动，使种子均匀散布于培养基中，但要避免将种子埋入培养基内，引起窒息死亡。播种密度以每瓶的种子数量以大致都能接触到培养基为度，太密时会影响发芽率及发芽后的正常生长。如果果实在采收前已经开裂，也可用上述同样的方法处理，若种子不下沉，可加几滴浓酒精。种子消毒后，用无菌水冲洗数遍，再用滤纸过滤的方法除去溶液，取出种子用于接种。

  （7）将播种后的玻璃瓶移入培养室或培养箱中或有散射光的地方，培养温度20℃～26℃，温度过高易褐变死亡，温度过低发芽慢。

  （8）1周左右，胚明显增大，补充2000～3000勒克斯的光照，每天10～18小时效果较好。接种后1～2种子变成绿色，表明胚上已生成叶绿素，1个月左右种胚突变种皮，长成顶端有绿色的叶原基，球体基部有丝状毛的原球茎。在播后的2～3个月，第一枚叶片从原球茎顶部中间生出。在出现2～3片叶时，原球茎伸长，并且有第一条根生出。在播种后4～5个月，较大的苗可出盆移栽于小盆中。较少的苗转移到相同培养基上继续培养。

  （9）如果播种较密，通常在长出第一枚叶片时就分瓶，分瓶后以兰花专用培养瓶效果最好，一般每瓶幼苗保持20株左右为佳。在播种后3个月，将其移入另外的培养基中，加大生长空间，形成能用于栽培的植株。

  （10）当石斛兰小苗长到3cm～5cm、有2～3株较好的根时，可将幼苗移出培养瓶，栽植到盆中。小苗从培养瓶中取出后，要轻轻用水清洗根部的培养基，栽培介质宜用切碎的苔藓、泥炭、碎木炭和少量砂配成的培养土，将小苗栽在小盆中，每盆3～5株。而后放在25℃左右的温室内，保持较高的空气湿度和较强的散射光。每周施一次液体肥料，并喷洒抗菌剂，1个月后可移至光线较强的地方。

  （11）随着植株的长大要及时换盆，并移入温室栽培。

  （12）石斛兰播种苗一般在出瓶后，2～3年左右能开花。

  2、培养基的选择

  石斛兰的播种培养基多种多样，不同的品种的最适培养基不同，比较常用的基本培养基有MS、改良MS、Nistch、N6、RE等。播种培养基中一般不需加激素就能萌发，但有些品种在加入低浓度的6-BA、椰子汁、香蕉汁时，能提高萌发率，并加快萌发速度和生长速度。

  培养基的配制

  首先要根据培养基配方，算好母液吸取量，并按顺序吸取，然后加入蔗糖溶液，并加入蒸馏水定容至所需体积，并用0.1mol/L的HCl或NaOH调整pH值（pH5.5～5.8），加入琼脂加热熔化，配制好的培养基要趁热分注，倒入试管、三角瓶或其它玻璃瓶等培养器皿中，一般至容器1/4～1/5左右，最后加塞或封口准备消毒。目前，为了运输方便，一些试管苗工厂已采用一次性的聚脂纤维袋。

  3、培养基的消毒

  由于培养基内有丰富营养物质，极适合细菌和真菌的养殖，造成污染，影响组培的成功，因此培养基消毒是必不可少的一个环节。消毒的方法一般有高温高压消毒和过滤消毒两种方法。