玫瑰组织培养的研究

玫瑰组织培养的研究

组织培养技术是跨世纪的生物技术之一，应用于玫瑰快速繁殖，已带来巨额利润［1］。玫瑰称rose，是蔷薇科蔷薇属植物，又称蔷薇、月季，园艺上统称现代月季。主要分布在北半球的温带和亚热带，是观赏价值极高的多年生灌木。我国的蔷薇属植物种类较多，目前栽培的园艺切花玫瑰品种主要来源于中国月季、厥蔷薇、黄玫瑰、欧洲玫瑰、香水月季、多花蔷薇、野玫瑰、光叶蔷薇等原种的种间杂交种［2］，如拿破轮、玛利娜、卡尔红、索菲亚、贝拉米、坦尼克、雅典娜唐纳小姐、金奖章等。

 1玫瑰组织培养的意义

 1.1快速繁殖玫瑰有性生殖能力差，大多观赏价值高的品种不形成种子，种子繁殖不现实。而玫瑰实生苗观赏价值较差，因此生产上必须通过野蔷薇扦插再嫁接进行繁殖。这样耗时、耗人力、耗财力，成本高，大规模生产困难。利用组织培养技术可以实现玫瑰优良品种的快速繁殖［3］，并且能保持原有的优良性状不变。玫瑰组培增殖系数为４～５，半年至一年内能获得上百万种苗。

 1.2获得无病毒植株玫瑰在生长过程中，能感染一种或数种病毒或类病毒。长期营养繁殖，如扦插、嫁接、分株，不仅不能脱毒，反而使病毒积累，严重影响玫瑰的品质，导致玫瑰观赏价值下降，比如花径变小、色泽变淡、产花减少、斑点较多、花形不规则、易感染病虫等。通过组织培养技术，利用玫瑰茎尖脱毒后，使玫瑰的种性得到复壮，生长势增强，花径增大，色泽鲜艳，抗病能力提高，产花量上升［4］。

 1.3培育新品种在组织培养过程中往往会发生芽变，芽变的结果导致花色变异、花的大小变异、花期变异、叶色变异、染色体数量变异等。在组织培养过程中，一旦发生芽变，准确切取变异芽，并将其繁殖成完整植株，可产生有特殊观赏价值的新品种。

 1.4种质资源的保存玫瑰种质资源丰富，按传统方法保存种质资源占地面积大，且资源易受人为因素和环境因素的破坏而丢失。用组培方法，用极小的空间就可长期有效地保存玫瑰的种质资源［3］。

 2玫瑰组织培养的方法

 2.1外植体选取从生长在田间或盆栽的优良品种植株上，选取生长健壮、无病虫害的当年生枝条的茎尖和幼茎。取材最好在晴天正午，并且取用植株上部的幼茎。阴雨天或靠近地面的幼茎，表面污染较为严重，难于消毒。玫瑰除用茎尖和幼茎做外植体外，也可以用叶片、叶柄、根、茎、原生质体、胚、花药、子房、花萼和花托做外植体［7］。

 2.2消毒灭菌及无菌苗的建立取玫瑰外植体，用5%～10%的次氯酸钠浸泡10～30min或用01%～02%的hgcl浸泡5～15min。用无菌水清洗7～10次后接种。也可先用75%的酒精浸泡20～30s再采用上述方法消毒。消毒灭菌完毕后，将幼茎切割成05～10cm长的至少带有一个节的切段，接种于培养基中［6］。

 2.3愈伤组织的诱导hill(1967)最早报道从杂交茶香月季（hybridtearose）的茎上诱导了愈伤组织，该实验证明在培养基中添加2，4-d或添加naa和激动素kt均能很快诱导出愈伤组织。随后不同实验以不同品种为试验材料，从叶、叶柄、根、茎、原生质体、合子胚、花药、子房、花瓣、花萼、和花托成功地诱导了愈伤组织。［7］

 2.3.1愈伤组织的成功诱导与品种的基因型有关?摇lloyd等（1988）曾研究roseprsica与xanthina，hybrida，clarissa，rcabrosa的愈伤发生能力，发现只有rosepersica与xanthina在ms基本培养基上，添加低浓度的bap和naa时，节间能产生愈伤，愈伤组织脆弱，呈淡黄绿色。kunitake等(1993)研究了roserugosathunb，rosemultiflora，roseallbacv，semiplenarosehybridacv，duplesroseharisonii，rosespinosissi的未成熟种子的愈伤发生能力，发现只有roserugosathurb能产生愈伤组织，品种rontl和soraya比品种baccara和mercedes更易产生愈伤(kintzios等，1999)。［7］

 2.3.2外植体类型?摇aren等（1993）详细地调查了rosehybridacvmeirutral不同外植体的愈伤诱导率，发现不同外植体愈伤产生的能力不同，叶为90%，根为70%，节间为55%，花药为19%。

 2.3.3激素激素也是影响愈伤生成的重要因素，rout等（1991）以landora为材料，在添加ba和naa，2，4-d的ms的培养基上，外植体在接种的7～12d后，在近轴面的叶柄和中脉处产生愈伤，愈伤组织诱导频率高达92%。在接种后15～20d，外植体茎切端处产生愈伤，诱导率为76%。生长素种类和浓度对愈伤产生能力的影响同样很大。早期实验多采用naa结合bap或ba等，近年来多采用2，4—d，并证明2，4—d是诱导愈伤的必要因素（kintzios等，1999；rout等，1996；vandersalm等，1996；vises—suwan等，1997）。进一步研究发现2，4-d对愈伤的诱导效果依赖于月季的基因型，如2，4—d浓度从113umol/l增加到181umol/l降低了rosehybrida栽培种“care-freebeauty”的愈伤诱导频率，但该浓度则对另一个品种“grandgala”无影响。对于“redsunblaze”而言，当浓度从113umol/l增加到452umol/l，则表现出愈伤的诱导率提高了，随后当2，4—d再增加，则显著地降低愈伤的诱导频率。愈伤组织在诱导愈伤组织的培养基上能得到很好继代培养（subculture、li等，2002）。vandersalm等（1996）证明2，4—d对诱导rosepersica与xanthina和moneyway产生愈伤是非常必要的，进一步添加低浓度的ba有正效应，但如ba浓度过高，则产生抑制作用。与以上实验结果不同，kintzios等（1999）则发现2，4—d对愈伤诱导有负影响作用，可能因为采用的外植体是成熟的叶片。

 2.3.4合子胚的发育时期对愈伤的形成能力也有影响?摇如处于心形胚的合子胚，其愈伤诱导率只有2%，子叶胚时的合子胚愈伤诱导率达到85%。［7］

 2.4不定芽的诱导月季的常规繁殖方式主要靠扦插、嫁接和压条等，繁殖系数低，远远满足不了生产的需要。80年代初，采取组织培养方法快速繁殖月季苗，用侧芽、顶芽、并诱导生根。第一报道月季不定芽形成见elliott(1970)，他在聚花月季（rosemultiflora）上成功地诱导了不定芽的形成，并诱导幼苗生根。zieslin和halevy(1976)报道细胞分裂素有利于提高不定芽的数量，但也诱导花器官败育或退化的频率。不定芽的诱导与供试材料的基因型有关，同时还与外植体的取材部位有关，来源于枝条中部的侧芽的繁殖速率最快（bressan等，1982）。培养基中添加蔗糖有增加丛芽数量的作用（langford和wainwright，1987）；加入低浓度的ga能进一步改善芽繁殖，95%的外植体能产生7个以上的不定芽（rout等1990）。能提高芽繁殖数量的物质还有月桂酸甲酯（voyiatzi等，1995）、乙烯（kevers等，1992）等。诱导不定芽的培养基为ms培养基添加低浓度的激素bap03～05mg/l，naa0004～03mg/l或iaa或ga00～20mg/l。［7］martin等（1981）调查了2125个玫瑰侧芽做外植体获得的无菌苗三年间在大田生长的情况，没有发现变异植株，这说明侧芽方式繁殖的玫瑰植株性状很稳定。

 2.5增殖培养玫瑰的增殖培养，一靠无菌苗切段繁殖，二靠诱导不定芽，形成从生苗；三靠愈伤组织形成体细胞胚或原球胚。将已长大的月季嫩茎切成带1～2个节的茎段，投入新鲜的增殖培养基上，5～6周进行一次继代增殖，增殖系数平均达4～6。在外植到培养10～15d内第一叶的叶原基伸长，第二叶片叶原基可见；15～20d侧芽伸长；25～30d长度达6～10mm，继代增殖会按几何级数增长起来。［5］增殖培养基可用不定芽诱导培养基，如ms+ba03～05+naa0004～03mg/l。

 2.6壮苗与生根壮苗培养的培养基为：ms+ba03～05+naa001～01或ms+ba03～05+iba03。［4］也可以壮苗为主，增殖为辅，使增殖与壮苗合二为一。玫瑰组培苗增殖与壮苗需光照10～12h，光照强度2000lx，温度24～26℃。［4］

 玫瑰在组培过程中，其生根能力因品种特性、所用植物材料及培养基成分而有较大差异，许多研究结果表明，玫瑰茎段微繁殖容易生根，使用植物激素iaa，iba或naa含量01～05mg/l，蔗糖含量2%～25%的ms培养基有利于玫瑰茎段生根。另外，光照、温度等对玫瑰微繁殖生根也有直接影响，bressan等（1982）研究指出，光照时间每天12h以上，光照强度适宜则有利于生根。一般情况下，玫瑰茎段组织培养8～10d内则可生根。［6］加入适量的活性炭有利于玫瑰生根。

 2.7炼苗与大田移栽炼苗和大田移植是玫瑰微繁殖获得成功的最后阶段。［6］组培幼苗由人为培养环境转移到天然生长环境中，环境条件发生巨大变化，湿度大幅度降低，温度不恒定，光照强烈，微生物多，故需炼苗过渡。一般玫瑰微繁殖炼苗需经过室内三天的取盖炼苗，然后将苗从瓶中取出，洗去根部培养基，定植在珍珠岩、泥炭、蛭石或沙土中，用3～5%的多菌灵喷洗。炼苗时要注意基质中的水分含量，水分太少，不能满足苗生长发育；水分太多，导致烂苗。炼苗中、后期要注意通气，给予足够的光照，其幼苗成活率可达80％以上。［6］

 3玫瑰组织培养中应注的问题———褐化现象

 褐化现象是指外植体在培养过程中切口产生的多酚类物质被氧化成褐色的醌类物质毒害植物自身，导致培养材料褐变死亡的现象。玫瑰在组织培养中褐化现象严重，可采取以下措施：

 3.1采用适宜的外植体比如实生苗茎尖、枝条顶芽、幼胚等，在取外植体之前对母树进行遮光处理20～40d。［1］

 3.2适宜的无基盐分适宜的无基盐分，降低蔗糖浓度，降低激素水平，加吸附剂05%～25%的活性炭可以减轻材料的褐变。［1］

 3.3在培养基中加入抗氧化剂和其他抑制剂如有机酸、蛋白质水解产物，氨基酸，硫脲，二氨基二硫化甲酸钠，亚硫氢酸钠，氰化钾，二硫苏糖醇多氨等，可有效的抑制褐变。

 3.4反复转移，降低温度，进行暗培养，增大培养基硬度，是控制褐常用且有效的方法。