蕙兰的无菌播种及根状茎培养技术研究

蕙兰的无菌播种及根状茎培养技术研究

[摘要]蕙兰是一种具有很高商业价值的兰科植物，传统上采用分株繁殖。研究其果实的发育时间和预处理方式对种子无菌萌发的影响，发现授粉后120d，种子的萌发率最高(为2.7%)，而0.1mol·L-1NaOH溶液对提高种子的萌发率没有明显作用。进而讨论了不同因素对蕙兰根状茎增殖的影响，结果表明：MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L或B5+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L的培养基最适于根状茎的增殖。

[关键词]蕙兰 无菌播种 根状茎 组织培养

中图分类号：S6 文献标识码：A 文章编号：1002－6908（2007）1120045-01

一、前言

近年来，墨兰、建兰的组织培养报道渐多,而关于蕙兰的报道则少见。本文探讨了其果实成熟度和NaOH溶液预处理方式对蕙兰种子萌发的影响，并由种子诱导出了发育良好的根状茎。进而研究了不同的培养基类型和NAA与BA的浓度配比对根状茎增殖的影响，提出了适合根状茎增殖的培养基配方，还繁殖出少量完整植株，为实现中国兰的大规模工厂化育苗提供科学依据和技术支持。

二、实验材料和方法

（一）实验材料

供试材料为经人工授粉后采收的盆栽蕙兰的蒴果。

（二）实验方法

1．人工授粉和蒴果采收。选取生长健壮、无病虫害的蕙兰植株作为母本。要求苗数在10苗左右，花葶3枚以上。按照程式君（1984）的方法，在母株开花之前事先收集另一蕙兰植株的花粉块放在滤纸上，卷成筒状，放在小瓶中，塞紧，置于干燥器内，放在4℃冰箱中保存。在母本花葶上每朵小花开放的第二天，除去其自身的花粉块，授以预先收集的花粉，每一花葶上保留2～3个发育良好的蒴果。将蒴果分为四组，分别于授粉后的第60、120、180、240d采收，供后续实验之需。

2．种子的无菌播种和原球茎的诱导。将采收的未开裂蒴果置于流水下冲洗干净，在超净工作台上先用70%的酒精浸泡1min，再用0.1%升汞溶液浸泡15min，无菌水冲洗5次。然后将消毒后的蒴果纵切为二，用镊子夹取着生于侧膜胎座上的种子，置于盛有无菌水的小烧杯中，使种子悬浮于无菌水上部，再用滴管将其移入培养基中，轻摇培养瓶，使种子均匀分布在培养基上。此外，另取一组种子，用0.1mol·L-1的NaOH溶液进行10、20、30min的浸泡预处理，消毒后接种于相同培养基上，比较其与未经过处理的种子在萌发率上是否存在差异，重复三次。在培养室中培养90d后统计萌发率。

无菌播种的培养基成分为1/2MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+

琼脂6g/L+0.2%AC，调节PH值至5.0～5.4。

3．根状茎的培养。播种60～80d后，种子陆续萌发，形成原球茎，30～40d后即发育成根状茎。将发育良好的根状茎转入不添加任何植物生长调节剂的MS+蔗糖6g/L+0.2%AC的培养基中，继代4次后，再将其转入以下9组培养基中：

（1）MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L

（2）MS+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L

（3）MS+NAA0.5mg/L+BA2.0mg/L

（4）W+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L

（5）W+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L

（6）W+NAA0.5mg/L+BA2.0mg/L

（7）B5+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L

（8）B5+NAA0.5mg/L+BA1.0mg/L

（9）B5+NAA0.5mg/L+BA2.0mg/L

上述各组培养基均添加3%的蔗糖和0.6%的琼脂，调节PH至5.0～5.4。每个培养瓶接种三条根状茎,重复三次。培养60d后统计根状茎增殖的倍数。

以上各试验的培养条件均为：温度25±2℃，光照强度2000lx，光照时间16h/d。

三、结果与分析

（一）果实发育时间与种子萌发率的关系

分别采收授粉后第60、120、180和240d的未开裂蒴果，经表面消毒后，在无菌条件下，取出种子，均匀地播于前述的培养基上。90d后统计萌发率，其结果见表1。

表3-1 果实发育时间与种子萌发率统计表

试验结果表明，授粉后种子能否萌发与果实成熟度密切相关。授粉后60d的果实，种子的胚发育不成熟，萌发率低；授粉后240d的果实，可能积累了过多的生长抑制物，萌发率也有所降低。以采收授粉后120d的蒴果，进行无菌播种，种子的萌发率最高。

（二）NaOH溶液预处理对种子萌发的影响

取一枚发育良好的未开裂蒴果，消毒后将其纵切，将种子分为4份，其中一份直接播种于前述培养基中，其余三份分别经0.1mol·L-1NaOH溶液处理10、20、30min后，用无菌水冲洗后再播种于相同培养基中。90d后统计各组的萌发率并重复三次，结果如下表2所示。

表3-2 NaOH溶液预处理与种子萌发率统计表

由上表不难看出，0.1mol·L-1NaO

H溶液浸泡处理对提高蕙兰种子萌发率的作用并不明显。

（三）培养基类型和植物生长调节剂浓度配比对根状茎增殖的影响

种子在培养基上吸水膨胀，不久胚细胞开始分裂，种胚增大，60～80d后陆续萌发，形成原球茎。原球茎不久即伸长形成根状茎，根状茎的生长具有极性，以合轴的方式进行分枝，先端可发育成芽。根状茎的表面有许多瘤状突起，表皮细胞伸长形成白色的吸收毛，可能与吸收水分和营养有关。旺盛生长的根状茎呈深绿色。

为避免其他因素的干扰，试验前先把发育良好的根状茎转入不添加植物生长调节剂的MS培养基中，连续继代培养4次。再将新增殖的根状茎分别转入述的9组培养基中，60d后统计根状茎增殖的倍数，结果见下表3。

表3-3 根状茎增殖倍数统计表

以上的结果表明：蕙兰根状茎增殖的最佳培养基的配方为MS+NAA0.5mg/L+BA0.5mg/L+蔗糖30g/L+

琼脂6g/L或B5+NAA0.5

Mg/L+BA1.0mg/L+蔗糖30g/L+琼脂6g/L。

培养60d后，根状茎的增殖倍数分别可达2.56和2.74。

四、讨论

（一）种子萌发和预处理

一般认为，兰属植物八成熟果实的种子的萌发率较高，即蒴果由绿色转变为黄棕色并且尚未开裂的时候，进行无菌播种效果最佳。但具体合适的萌发时期，因种而异。本试验表明，授粉后120d左右的蕙兰种子萌发率最高，可达2.7%。李哖（1992）认为，墨兰应采用授粉后150d的果实，建兰则为190d。

兰花虽然种子细小，但数目众多。对于种子难以萌发的地生兰属植物而言，通过合适的预处理方式，提高种子的萌发率，是获取充足后续实验材料的有效手段。段金玉（1982）等报道，未经处理的地生兰种子，在播种后6～9个月内，萌发率最大不超过3%，最小的不足1%。本试验结果表明，0.1mol·L-1的NaOH溶液对种子进行浸泡处理的方式，并非适用于所有的兰属地生种，尚需要探索能显著提高蕙兰种子萌发率的合适预处理方式。

（二）根状茎培养

与附生类兰花不同，大多数地生兰属植物由种子产生的原球茎并不直接分化成幼苗，而要经历一个根状茎阶段。而根状茎阶的增殖率主要受培养基类型、植物生长调节剂的浓度、组合和比例的影响（Arditti和Ernst,1993）。其中细胞分裂素、如BA、TDZ等被证实对许多兰花的植株再生最为有效（Seeni和Latha,1992;Nayak等，1997），但在本实验中，蕙兰对BA的浓度差异并不敏感，这也许是由于根状茎中内源激素的影响。此外，在培养过程中发现，蕙兰根状茎的发育并不同步，因为继代时需要对根状茎进行切割，从而导致培养体系中始终存在着发育阶段差异悬殊的分生组织、发育程度不同的根状茎和少量不同叶龄数的幼芽。将幼芽切下转入1/2MS+NAA2.0mg/L+蔗糖20g/L+琼脂6g/L+0.5%AC的培养基中，不久幼苗即生根，60d后苗高10厘米，有3～5条根。若不转换培养基，幼苗也可以继续生长，但叶幅狭细且较瘦弱。据Shimasaki和Uemoto（1990）的报道，NAA/BA比值低，导致寒兰的根状茎形成许多原球茎，但原球茎发育成小植株的过程缓慢，NAA/BA比值高，则使根状茎产生异常细长的幼苗。本次对蕙兰根状茎的研究也获得了类似的结果。

注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。

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