高等植物雄性不育的细胞生物学研究进展

高等植物雄性不育的细胞生物学研究进展遗传性雄性不育在植物界中是一种常见现象，据统计已经在43科，162属，320个种和297个种间杂种中发现了雄性不育现象(Kaul 1988)，并且这个数目还在不断增加。由于雄性不育是杂种优势利用的基础，几十年来对雄性不育机理的探索一直是一个非常活跃的研究领域，特别是近年来对雄性不育的分子生物学研究更是成果丰硕，不断有关于雄性不育分子机制的文章总结这方面的研究成果并提出了若干相应理论和假设( Araya 等1998；Hanson 和 Bentolila 2004；曹双河等2005)，丰富了杂种优势利用的理论基础，提高了人们对雄性不育机理的认识。雄性不育花药结构的细胞生物学研究主要探索花粉败育的过程，是将雄性不育的分子水平研究和个体调控育性变化的研究联系起来的中间环节，对全面认识植物雄性不育机理有很大帮助。对花药细胞结构与功能的分析以及花粉细胞中重要的细胞生物学事态的分析是全面认识不育基因调控花粉败育过程的基础。我国的雄性不育研究和利用在国际上处于领先地位。近年来应用现代细胞生物学技术对多种雄性不育农作物的花药败育过程做了研究，取得了一些新的结果。本文着重从细胞水平介绍有关作物花药败育过程的最新研究进展，包括绒毡层发育、 ATP 酶、Ca2+浓度、细胞骨架和细胞程序性死亡等诸多因素与雄性不育的关系。 1 绒毡层发育 绒毡层是花药壁的最内层体细胞，直接与花药药室中的花粉母细胞及以后发育中的花粉接触，是将孢子体组织的物质输往雄配子体的最后中转站，对花粉的正常发育具有十分重要的作用(胡适宜1984；Pacini 1997)。正因为绒毡层细胞与发育的小孢子或花粉之间存在着一种直接接触的“生化对话”关系，当这种正常的交流出现紊乱时，就会导致雄性不育。许多作者都认为雄性不育的发生是与绒毡层正常的发育途径受干扰有关( Aarts 等1997；Jin 等1997；Taylor 等1998)。在光敏核不育水稻中，绒毡层是在原位解体的。可育花药的绒毡层细胞在小孢子发育晚期开始退化，到二胞花粉时期己基本消失。在绒毡层退化过程中，小孢子萌发孔都面向绒毡层，常常可看到正对着萌发孔的绒毡层细胞区域首先变薄，而在两个花粉粒之间的区域仍保持较厚的状态。从这种结构特征推断绒毡层细胞的解体是由于具有大液泡的晚期小孢子通过萌发孔的吸收而造成的。在不育花药中，花粉的败育发生在小孢子发育时期，绒毡层细胞不但没有退化，而且一直可保留到花药成熟的开花期。这也从另一方面证实了在花粉败育后，失去花粉吸收的外力作用，绒毡层细胞可继续存活下去，表明花粉的发育前提之一是绒毡层细胞的适时退化(田惠桥等1993)。以前的许多研究者报告过绒毡层发育异常会造成花粉的败育。近年来仍不断有类似的报告：Taylor 等(1998)在拟南芥的 ms7 雄性不育突变体中发现绒毡层提早降解影响了花粉发育，是导致花粉在单核靠边期败育的直接原因。Fei 和 Sawhney 等(1999)在对拟南芥雄性不育突变体 ms32 超微结构的观察中发现绒毡层细胞在减数分裂前期就形成了合成和分泌胼胝酶的粗糙内质网，成垛叠状(而相应野生型的内质网则到了四分体时期才开始形成)，这样就导致了包裹花粉母细胞和四分体的胼胝壁过早降解，致使花粉败育。Chaubal 等(2000)对玉米两个雄性不育突变体 ms23 和 ms32 小孢子发育过程的研究中发现本应形成绒毡层的细胞又分裂形成了两层细胞 t1 和 t2，且二者都不能正常分化，导致花粉母细胞在减数分裂前期 I 时就开始败育。Suzuki 等(2001)在对高温胁迫下绒毡层细胞的超微结构观察中看到高温影响了绒毡层细胞的内质网膜结构，从而导致了绒毡层的提前降解并使花粉的败育。Smith 等(2002)在对大豆细胞质雄性不育花药的电镜观察中发现绒毡层细胞中线粒体内膜首先发生了降解，内腔异常扩大；接着内质网呈现出了不规则的同心环结构，这些异常变化使绒毡层细胞降解，最终影响了小孢子的发育，使花粉败育。Zhang 等(2002)在拟南芥雄性不育 apt1-3 的花药中观察到起源于绒毡层的营养物质减少，推测绒毡层细胞生物合成活性的下降影响了小孢子发育，导致花粉败育。谢潮添等(2004)在白菜细胞核雄性不育系中发现：白菜花粉粒中的储存物质是脂类物质。但糖类物质是白菜运输的主要形式。在花药发育的早期，体内运输到花药中的糖类物质先以淀粉粒的形式储存在花药的药壁组织中。当花粉发育到小孢子晚期时，花药绒毡层细胞将其他药壁细胞中的糖类转化成脂类供给发育的花粉。不育花药的绒毡层细胞不将糖类物质转化成脂类物质。 用基因工程技术也证明了绒毡层细胞与小孢子发育的紧密关系：将在绒毡层细胞内特异表达的启动子与细胞毒素的 mRNA 酶基因融合( Mariani 等1990)或 β-1，3-葡聚糖酶基因融合( Worrall 等1992；Tsuchiya 等1995)后，转入到正常植株中都导致了绒毡层的正常发育受到干扰，从而诱导了花药败育。 2 ATP 酶 ATP 酶在生物体内广泛存在，它催化 ATP 的水解，对各种组织器官的运动、物质运输、信号传导、细胞内物质的合成与分解等代谢活动中能量的需求起重要作用。花粉的败育可以由多种因素引起，能量缺乏是导致花粉败育的一个原因。光敏核不育水稻不育花药的 ATP 含量从花粉发育早期就明显低于可育花药，提示 ATP 含量的降低与花粉不育有关(邓继新等1990)。花药细胞中 ATP 酶的多少反映了花药中能量供应的状况。Sane 等(1997)分别从高粱不育系、保持系和恢复系花药的线粒体膜上分离得到 F1-ATP 酶，发现它们之间的动力学特征有明显的不同，不育花药中的 ATP 酶动力要比保持系和恢复系中的低。虽然对这种动力学特征的不同与花粉育性的关系还不清楚，但很可能不育系花药中催化水解 ATP 的效率过低影响了花粉发育。近年来在雄性不育花药中的 ATP 酶定位研究也取得了一些结果。姚雅琴和张改生(2000)对 K 型小麦雄性不育系及其保持系花药发育中发现：两种花药的药壁和药隔细胞中 ATP 酶的活性变化几乎没有差别，表明不育系花药体细胞组织中的营养运输和供应系统发育正常，花粉败育与营养物质的供应无关。但在不育系和保持系的花粉粒中，ATP 酶的分布则存在着差别：保持系花粉 ATP 酶活性随着小孢子发育逐渐加强，而不育系的则不增加，由此认为是花粉中的 ATP 酶异常与其败育有关。孟祥红等(2000c)在光敏胞质不育小麦花药发育过程中看到早期败育的花粉中花粉壁内、花粉表面、质膜及胞质内无 ATP 酶分布；绒毡层细胞提前降解；其他三层药壁细胞中很少有 ATP 酶分布；药隔维管束及薄壁细胞质膜上 ATP 酶也很少。因此他们认为体内向花药提供的物质及能量供应不足可能是造成早期花粉败育的原因。在水稻不育系“马协”花药药隔中的 ATP 酶比可育花药的少，作者认为很可能是营养物质卸出存在障碍，导致了花粉的败育(关和新等2000)。可育和不育花药在药壁和药隔体细胞组织中 ATP 酶分布的差异反映出体内向花药中运输物质能力的强弱；而可育和不育花粉细胞质中的 ATP 酶分布差异则可能反映出花粉自身的生活力状态。不同雄性不育植物中花药体细胞组织和花粉细胞质中 ATP 酶的不同分布特征也反映出花药不同部位的 ATP 酶代谢发生异常都有可能导致雄性不育发生。水稻可育花药在减数分裂之前的 ATP 酶很少。减数分裂后花药中 ATP 增多。在花粉内、外壁的形成过程中都聚集了很多的 ATP 酶，但两层壁中的 ATP 酶来源不同。二胞花粉的营养细胞比生殖细胞含有更多的 ATP 酶。两个精细胞之间 ATP 酶也有数量上的差异(王雅英等2006)。ATP 酶分布的时、空特征提示它在花药发育过程中起重要的功能，它的异常将导致花粉的败育。 3 Ca2+ 浓度 钙是植物生长发育过程中不可缺少的元素之一，Ca2+作为植物的第二信使广泛参与并调节着植物体内的生理生化反应，成为近年来植物生物学的研究热点之一。钙信使系统起作用的最初事态是细胞内钙离子浓度在时间和空间上的变化，通过与钙调蛋白的结合直接激活了蛋白激酶的活性或间接地调控其它酶类蛋白的活性，将外部刺激(如光、激素、重力等)转换成对植物细胞代谢活动的调控( BuSh 1995)。近年来对Ca2+在被子植物生殖过程中的作用也引起了人们的极大兴趣，如 Tirlapur 和 Willemse (1992)用荧光染料金霉素( chlorotetracycline，CTC )研究了芝麻掌( Gasteria verrucuosa )花药发育中膜钙的分布动态。Gorska-Brylass 等(1997/98)观察到 Chlorophytum elatum 花粉营养细胞中的钙离子浓度要远低于生殖细胞中的，并由此推断钙离子在营养细胞和生殖细胞之间的差异对二者以后的发育可能起重要的调控作用。Tian 等(1998)在光敏核不育水稻中观察到：在可育花药的小孢子发育后期，钙沉淀颗粒大量分布在绒毡层和药室中，特别是在花粉和乌氏体的表面，但在小孢子细胞质中Ca2+颗粒很少，这表明Ca2+可能参与了花粉壁的形成和引导物质流向药室的过程。在不育花药的药壁细胞中，Ca2+颗粒大量分布在中层，而在绒毡层细胞中很少。另外，在败育花粉的细胞质中积累了较多的Ca2+颗粒。他们认为不育花药中Ca2+的异常分布可能影响花粉的发育。孟祥红等(2000a)在光敏胞质不育小麦花药发育过程Ca2+分布的研究中也观察到败育花粉中大量积累Ca2+，因此认为花粉败育与Ca2+的异常分布密切相关。利容千等(2001)在水稻红莲-粤泰不育系与保持系花药中Ca2+分布的研究中也观察到败育花粉细胞质中大量积累Ca2+，而相应的保持系正常花粉细胞质中则没有。此外，在不育系花药的药隔维管束鞘、导管和筛管细胞的内壁，胞质和液泡中分布有许多大小不等的Ca2+颗粒(而保持系正常花药药隔组织中几乎没有Ca2+沉淀颗粒分布)，因此认为药隔组织Ca2+异常分布现象可能影响了药隔细胞正常功能的发挥，从而影响药壁细胞功能和花粉的发育。最近，在白菜细胞核雄性不育花药的钙分布研究中发现，可育花药中的钙参与了花粉液泡的形成与降解过程：小液泡是由内质网膨大形成的，将要形成液泡的内质网内部聚集了较多的钙颗粒，以后在小液泡膜上特异性地附着许多钙颗粒。在二胞花粉中，当大液泡分解成小液泡时，小液泡膜上又特异性地附着许多钙颗粒。在不育花药中，尽管绒毡层细胞和药室内积累了许多钙颗粒，但小孢子中的钙颗粒一直很少，小孢子也不形成体积较大的液泡。最后，处在高钙、可能也是高渗透势药室环境中的小孢子以细胞质收缩方式败育(谢潮添等2005a)。 以上的研究结果表明在适当的时间和空间，花药中一定浓度的Ca2+对花药和花粉的发育是必需的。在花药药室中较高的Ca2+浓度可能在引导物质流向药室中起作用。但在高Ca2+浓度环境中，水稻和小麦的花粉细胞内又必需保持一个较低Ca2+的状态才能使花粉正常发育。而在白菜中花粉内过低的Ca2+也会导致花粉的败育。孟祥红等(2000b)设想花粉内部Ca2+状态的维持可能通过花粉质膜或钙库包膜上存在的钙离子通道控制Ca2+向细胞质内流，而细胞质内Ca2+的外流则主要由质膜或钙库细胞器膜上存在的钙泵——Ca2+-ATP 酶来控制，钙泵的活性变化调节着胞内Ca2+浓度的变化，维持细胞内的Ca2+稳态，因此质膜上 Ca2+-ATP 酶活性的强弱就决定着花粉细胞质中Ca2+浓度，调节花粉的育性。他们在光周期对光敏胞质不育小麦花药发育过程中观察到，在短日照条件下可育花粉的外壁、内壁及质膜上 Ca2+-ATP 酶的分布量逐步增加，至三核花粉时期，花粉的内壁、质膜上分布有大量的 Ca2+-ATP 酶。而在长日照条件下不育花粉中的 Ca2+-ATP 酶的分布量虽然略有增加，但在花粉开始败育时，花粉质膜上 Ca2+-ATP 酶的分布量比可育花粉少得多。因此，他们认为可育花粉质膜 Ca2+-ATP 酶分布的量大，活性高，使花粉在药室的高钙环境中能有效地排出Ca2+，保持花粉内较低的Ca2+水平。在不育花粉中，质膜 Ca2+-ATP 酶分布量少，活性低，不能将细胞内的Ca2+有效地排出，造成Ca2+在花粉细胞质内大量积累，产生Ca2+中毒，导致细胞内生理生化代谢紊乱，最终导致花粉败育(孟祥红等2000b)。 4 细胞骨架 细胞骨架是真核生物普遍存在的一种细胞器，包括微管系统和微丝系统两个部分，参与细胞中多种功能( Cai 等1997)。近年来对雄性不育花药组成细胞的细胞骨架分布特征也做了一些研究，但由于研究方法的限制( Zee 和 Ye 1998)，这方面的研究成果还很有限。 肌动蛋白是真核生物细胞中普遍存在的一种重要蛋白质。肌动蛋白构成细胞骨架中的微丝系统，参与染色体运动、细胞器运动、胞质流动和顶体运动等生命活动，在细胞的生长、发育过程中起着重要作用( Pierson 和 Cresti 1992；Cai 等1997)。植物正常花粉含有丰富的肌动蛋白已被许多实验所证明( Heslop-Harrison 和 Heslop-Harrison 1992；Foissner 等2002)。滕晓月等(1986)用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳方法对小麦、白菜的雄性不育系与保持系的花粉和花药中肌动蛋白的含量做了测定，结果发现小麦保持系花粉中的肌动蛋白区带十分明显，而在不育花药中的肌动蛋白区带很弱。将电泳凝胶片用双光束双波长分光光度计进行扫描，测定了不育系与保持系中肌动蛋白的含量，结果显示保持系兔肌动蛋白的峰比不育系高的多，说明小麦等雄性不育和花药中肌动蛋白含量低有联系。李艳红等(1999)利用反义基因技术，将反义豌豆肌动蛋白基因与花药/花粉特异性启动子连接，构建成“雄性不育基因”嵌合体及其植物表达载体并导入小麦中，获得了大量小麦转基因雄性不育植株，证明了肌动蛋白的基因表达受阻时可影响花药的育性。 Zee 等(2001)在水稻光温敏核雄性不育系培矮 64s 小孢子母细胞减数分裂期间，发现各发育阶段细胞内的微管骨架呈现许多不正常现象，如：(1)在偶线期没有极性分布的微管；(2)在小孢子母细胞减数分裂期间出现许多特别粗的微管束；(3)在终变期围绕核的微管宽带结构松散，内含微管的数量少。这些异常现象可以作为不育花粉败育的早期检查指标加以利用。Ye 等(2003)在对水稻雄性不育系“珍汕97A”的微管骨架研究中也发现了一些异常现象，如小孢子母细胞内出现液泡，核中染色质凝集，微管荧光很弱，没有清晰的微管丝结构，细胞质中有许多点状荧光。小孢子母细胞减数分裂形成的四分体也没有清晰的丝状微管结构等。由此可见，早在小孢子败育之前，小孢子母细胞内的骨架系统就发生了显著变化，细胞骨架系统的紊乱过程也是花粉败育过程的一种表现。 细胞骨架紊乱导致细胞死亡的现象比较普遍。但导致花粉细胞骨架紊乱的上游因素和细胞骨架紊乱后如何影响细胞发育过程的细胞学变化还不清楚。在高等植物的雄性不育研究中花粉细胞骨架紊乱影响花粉发育过程则一无所知。将细胞骨架知识应用到雄性不育机理的研究是一个新尝试，值得深入研究。 5 细胞程序性死亡 在高等植物的生活周期中，有些部位的器官、组织和细胞会在个体生活周期结束之前死亡，这种死亡是对外界环境变化的生理反应，是由外部信号引起的细胞自主死亡过程，称为细胞程序性死亡( Programmed Cell Death，PCD )( Pennell 和 Lamb 1997，Gray 和 Johal 1998)。细胞学研究表明，在花药成熟之前，作为正常有性生殖过程的前提，有些花药组织以精确的时间顺序经历细胞死亡过程，如果这些细胞的死亡过程发生了变化则往往导致不育。最典型的例子是花药绒毡层，它是花药壁的最内层体细胞组织，通常在花粉发育的特定时间内死亡，在成熟花药中已不存在( Piffanelli 和 Murphy 1998：Papini 等1999；Wu 和 Cheung 2000；田惠桥2002)。在光敏核不育水稻的可育花药中，与花粉粒接触的绒毡层细胞部位先发生凹陷现象，表明绒毡层细胞程序死亡过程受小孢子发育的影响；在不育花药中，由于小孢子的败育，绒毡层的细胞程序死亡不发生或推迟，从另一方面也证明了花粉发育与否对绒毡层细胞程序死亡的影响(田惠桥等1993)。但在白菜细胞核雄性不育花药中无论花粉是否败育绒毡层细胞都按时发生细胞程序死亡过程，在发育后期的不育花药中，绒毡层细胞依旧发生解体。到开花时，不育花药壁也是只剩表皮和药室内壁两层细胞(谢潮添等2004)。对该种白菜花药的超微结构观察发现，败育花药在花粉母细胞时期就表现出结构的异常(谢潮添等2005b)。进一步用 DNA 电泳方法检测，不育花药在花粉母细胞时期就出现了细胞程序死亡的 DNA 梯状条带特征。这与超微结构观察结果相吻合。因此，白菜细胞核雄性不育的花粉是通过细胞程序死亡过程败育。在可育花药中，到小孢子发育早期才出现 DNA 梯状条带特征，这很可能是绒毡层细胞发生细胞程序死亡的结果。花药发育过程中绒毡层细胞发生退化的现象早已被发现，对绒毡层细胞的异常导致花粉败育也早被认识。如果用细胞程序死亡的观点探索绒毡层细胞的退化和花粉败育的过程，不仅为植物细胞程序死亡研究增加新内容，也在植物雄性不育机理研究中开辟了一个连接分子生物学研究和细胞生物学研究的新方向。 6 结束语 高等植物中雄性不育有多种类型，原因复杂：按花粉败育的进程划分，有发生于减数分裂时期，小孢子时期和二胞花粉时期发生败育的类型；就败育的遗传因子看，有细胞质不育和细胞核不育两种类型；按环境因素的影响划分，有对光照敏感和对温度敏感的类型。对这些不同雄性不育植物花粉败育发生的时间和过程需要用各种细胞生物学技术进行研究。适时总结这些研究结果，综合分子生物学研究提供的有关雄性不育基因的生物信息，将使我们对植物雄性不育机理的认识更全面，为农作物的杂种优势利用提供理论基础。 作者:谢潮添 魏冬梅 等 来源:植物生理与分子生物学学报