激光辅助显微切割技术分离植物细胞研究进展

激光辅助显微切割技术分离植物细胞研究进展

摘要 LAM是一种强大的工具，可用于从获取的生物标本中分离特定的组织、细胞型甚至器官，这有益于RNA、DNA、蛋白质的提取。分析该技术的原理及在植物研究中的重要性和优越性，介绍了LAM的工作原理及发展概况，并对其发展前景进行了展望。

关键词 LAM；激光辅助显微切割；分离植物细胞

中图分类号 Q94-336 文献标识码A文章编号1007-5739（2008）11-0099-01

植物体是由彼此相互联系的多种类型细胞所构成，正是由于这种结构上的复杂性，目前多数的研究都是通过分析混合组织样品来获得数据。虽然这些研究提供了一些有用的信息，但是有时对某些结果却不能做出很好的解释，尤其是某一种类型细胞占组织的主要部分，而研究对象只是暂时存在其中或细胞数量相对较少的时候，具有很大的局限性。因此，为了获得特定类型细胞的准确信息，分离出同质的目标细胞就显得非常重要。

1激光辅助显微切割（LAM）的优越性

已报道过的从植物中分离同质细胞样品的方法至少有3种。一种是从其中分离原生质体，这种方法能够获得很多同一种类型的细胞，但可能导致基因或蛋白表达发生未知的变化。另一种是用毛细管从植物活体中获得植物细胞组，所获得的细胞样品虽然能进行部分代谢、基因表达和蛋白表达的分析，但数量上的限制使得应用这种方法很难采集到足够数量的单纯种类细胞样品来进行全局分析（尤其对RNA和蛋白质）。此外，为了保持细胞特定的生理状态，样品可以在固定、包埋、切片后，从冰冻或者石蜡包埋的组织中分离，分离技术包括直接手工分离和激光显微切割分离。激光捕获显微切割技术与以上其他方法相比，能够精确、快捷地获得大量的特定种类细胞样品，显现出极大的优越性。LAM是一种强大的工具，可用于从获取的生物标本中分离特定的组织、细胞型甚至器官，这有益于RNA、DNA、蛋白质的提取。LAM在生物研究的许多领域已经是一个常规技术，现在也已经成功用于植物组织的研究。

2LAM的基础原理及发展

自1996年激光捕获显微切割技术首次采用以来，已经有多种激光捕获显微切割系统得到开发，文献报道中经常使用的是Arcturus Engineering公司的PixCell II系统和P.A.L.M.Microlaser Technologies公司的PALM Microbeam系统。

PixCell II系统属于经典的激光捕获显微切割技术，它的原理很容易理解。在显微镜下，用激光束照射特殊的转移膜使其熔化，黏附组织切片上的靶细胞，提起转移膜，使黏附的靶细胞和所有非靶细胞分离。其主要操作步骤为：将制备好的切片放在倒置显微镜载物台上，调整表面贴附有1层乙烯乙酸乙烯酯（EVA）膜的塑料帽，使其覆于切片的组织表面，并使目的细胞（群）位于视野中心；发射激光束，瞬间升温使EVA膜局部熔化，渗透到目的细胞周围，随即迅速冷却固化，EVA膜即与其下方的细胞紧密黏合在一起；揭起EVA膜，被捕获的目的细胞与EVA膜一起脱离切片上的其他组织。透明的热塑性EVA膜含有吸收近红外线的特殊染料，在整个激光捕获切割过程中发挥着重要的作用。它不吸收显微镜所使用的可见光，但当使用波长与该染料所吸收的光波长相一致的激光束照射时，激光的能量绝大部分被EVA膜吸收，随着温度的升高，EVA膜的黏滞度急剧下降。这一特性可保证EVA膜局部的轻度加热就能使其渗透到细胞间隙并迅速冷却，固化成牢固的连接，以使目的细胞脱离切片。

PALM Microbeam系统的原理是利用氮激光来切割感兴趣的区域，然后用激光光压将分离的样品弹入装有裂解液的管盖中，具体分3种情况：当组织细胞间是相互分离的时候，可以直接用光压弹射；若用激光切割的组织较小的时候，在切割完成时，样品在切割激光作用力下直接飞入装有裂解液的管中；若切割组织比较大，则在切割完成后要再加1次激光脉冲将样品弹入装有裂解液的管中。这种技术相对于经典的激光捕获显微切割技术来说，有以下优点：①不需要特制的贴附有EVA膜的塑料帽，可减小试验消耗。②采用激光压力弹射技术使样品从载玻片到管盖逆重力飞行，可保证样品不受污染。由于这种技术更具优势，因此近年来该系统得到了越来越广泛的应用。

3展望

随着新一代系统的出现，LAM的操作已经简单化。许多动物组织的试验结果表明，由激光捕获显微切割得到的样品可以被成功地应用在基因组、转录组和蛋白质组分析中。目前，激光捕获显微切割技术的局限在于它要求靶细胞在形态上容易辨认，但目前已经发展出一些可以用来协助识别某些特定细胞的方法，例如免疫组织化学、荧光原位杂交等。相信随着激光捕获显微切割技术在医学和动物研究中被越来越广泛而深入地应用，植物领域研究中也可以得到更多的借鉴。

4参考文献

[1] ROBERT C. DAY，UELI GROSSNIKLAUS RICHARD C. Macknight. Be more specific! Laser-assisted microdissection of plant cells[J]. Trends in Plant Science，2005（10）：397-404.

[2] 聂玉哲，张晓磊，李玉花.激光捕获显微切割技术及其在植物研究中的应用[J].植物生理学通讯，2006（4）：695-697.