家庭环境下进行组培的探讨与建议（下）

  二、进行组织培养前的准备：
    1.培养容器和玻璃仪器的准备：
    进行培养基的配制首先要准备好培养瓶和配制使用的玻璃仪器。培养瓶一般使用各种果酱瓶，要先用洗洁精浸泡瓶子4~8小时，再用流水冲洗数次。其他的玻璃仪器同样需要这样清洁，直到玻璃壁上不挂水珠而是成为水膜为止。清洗完毕的玻璃容器要倒扣，空去瓶内的水。

    清洗干净的容器要注意防尘，尽量放置在玻璃柜中。更简单的是用干净的毛巾将容器盖住。
    移液管要用吸球来清洗，反复用蒸馏水吹吸直到洁净为止，将移液管放置在一个长筒中，便于使用。一般移液管只能使用一次，即要清洗，所以有多必要准备几只移液管，建议：10ml/2支，5ml/2支，1ml/5支。
    2.培养基的配制：
    经典的组织培养用培养基是ms配方，其基本上划分为：大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、植物激素、糖和支持物。这些成分的用量都在毫克级，用普通天平是难以称量的，为了解决这个问题，我们可以按比例放大各成分的用量配制成母液，使用的时候按一定比例加入即可。
    下面我将一种ms培养基的母液配制方案公布如下：
    大量元素：硝酸铵66.0克；
    硝酸钾76.0克；
    无水氯化钙13.3克；
    七水硫酸镁14.8克；
    磷酸二氢钾6.8克。
    以上分别溶解后合并定容到1升，每配制1升标准ms培养基取25毫升。
    铁盐：七水硫酸亚铁5.56克；
    乙二胺四乙酸二钠（edtana）7.46克。
    以上两种分别加热溶解，混合，定容到1升，调整ph到5.5以下，每配制一升ms取5毫升。
    微量元素和有机复合物的用量过于微小，为了简便我们可以用蔬菜提取液或者马铃薯提取液代替。通常我们习惯用100克菠菜加100ml的水煮沸10分钟，过滤留滤液，每配制1升ms培养基加入20~50毫升提取液。同样也可以使用带皮马铃薯100克加200毫升水煮沸15分钟，过滤留滤液，每升ms加入50~100毫升即可。
    加入上述各组分后，每升ms培养基还需要加入白砂糖30克，琼脂7克。这里要说明的是，糖和琼脂都是可变的量，要根据需要调整。另外制作果冻用的卡拉胶也可以代替琼脂，透明度更好。
    上述各成分加入后，定容到800毫升左右，用微波炉加热，直到琼脂全部溶解为止。此时加入所需的植物激素（通常配制成0.1%溶液，这样每取1毫升，换算到培养基中就是1ppm）。然后加水定容到1100毫升（1.1升），之所以多出0.1升是为了抵消分装和消毒中的损耗。最后用酸碱调整ph到5.8~6.0。
  3.使用ms原粉配制培养基：
    目前国内的一些化学品公司开发了简便的ms培养基原粉，大大简便了培养基的配制，根据不同公司的说明选择培养基的种类。下面就以泛生化学品公司的ms原粉为例：泛生化学品公司生产的ms培养基原粉，包括了大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖和支持物，他们的支持物是一种人工合成的半乳糖硫酸脂——polygal，这种物质作为支持物虽然提高了成本，但是无论是透明度还是强度都优于琼脂，更重要的是ploygal对组织的褐变有一定的抑制作用，对初学者尤为重要。一般称取ms原粉40克，加水800毫升，微波炉加热溶解，加入激素，定容到1100毫升（1.1升），调整ph值到5.8~6.0。
    值得指出的是polygal还有一个特点，他对ph和灭菌时间的敏感性很强，如果培养基配制和灭菌出现问题，他会变色来提醒实验者培养基出现问题，这个也对初学者有一定的帮助。泛生公司也提供纯品polygal供研究使用。
    泛生公司的ms原粉价格大约是50元1000克，能制备20升ms培养基。这对于家庭做组培的爱好者来说，花50元钱可以使用一两年。
    4.分装：
    将配制好的培养基分装在培养容器中，注意要趁热分装，因为琼脂在40度以下就会凝固。每个培养瓶装培养基大约是瓶容积的1/6~1/5，注意不要将培养基挂在瓶的外壁，这样容易造成污染。分装后用聚丙烯薄膜或着方便面的袋子封口，用胶圈固定（胶圈尽量选择自行车的内胎，这种胶圈比较耐热）。
    5.灭菌：
    采用家庭压力锅消毒，建议到医疗器械用品商店买一些“灭菌效果试纸”，它们可以指示灭菌效果，当灭菌达到效果时会变色。把试纸和培养基同时放入锅内，加热到有大量蒸汽冒出，再加上压力伐，维持小火30~40分钟。
    灭菌完毕后自然冷却，将培养基取出，放在阴凉无尘处备用。
    6.接种箱的准备：
    新作的接种箱必须要清洁干净，尽量做到无死角。每次使用前2小时，将操作所需要的全部物品放入接种箱，再用一个小烧杯加入3~5克高锰酸钾放入接种箱内，在箱内向烧杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液，大约几秒钟后会看到甲醛蒸汽出现，这样可以对接种箱内的所有物品进行初次消毒；同时打开紫外线灯照射。紫外线灯是高电压穿激汞蒸汽产生的，紫外线进行第二道灭菌，在紫外线照射大约15分钟后，会激发氧气形成臭氧，臭氧作为第三道灭菌防线，这样经过三次灭菌，接种箱基本上可以达到无菌标准。
    在操作前15分钟内，向刚才蒸发甲醛用的烧杯中倒入5毫升浓氨水，因为甲醛对人体有毒害作用，氨水可以和甲醛形成一种叫做“六亚甲基四胺”的固体物质，从而中和了甲醛的刺激性蒸汽。这个时候紫外灯不要关掉，要继续照射，直到操作前5分钟关闭，维持黑暗5分钟，然后再打开日光灯进行操作。维持5分钟黑暗的原因是，紫外光对微生物的杀灭是作用于dna的胸腺嘧啶，形成四聚体，但是微生物具有一种光复活蛋白，可以在有可见光的环境下还原胸腺四聚体，而使微生物复活，这个作用叫做“光复活作用”，所以在关掉紫外灯后必须维持黑暗几分钟，避免光复活作用的出现。