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家庭环境下进行组培的探讨与建议(下)

养殖方法2022-03-29 10:52:05
  二、进行组织培养前的准备:
    1.培养容器和玻璃仪器的准备:
    进行培养基的配制首先要准备好培养瓶和配制使用的玻璃仪器。培养瓶一般使用各种果酱瓶,要先用洗洁精浸泡瓶子4~8小时,再用流水冲洗数次。其他的玻璃仪器同样需要这样清洁,直到玻璃壁上不挂水珠而是成为水膜为止。清洗完毕的玻璃容器要倒扣,空去瓶内的水。

家庭环境下进行组培的探讨与建议(下)

    清洗干净的容器要注意防尘,尽量放置在玻璃柜中。更简单的是用干净的毛巾将容器盖住。
    移液管要用吸球来清洗,反复用蒸馏水吹吸直到洁净为止,将移液管放置在一个长筒中,便于使用。一般移液管只能使用一次,即要清洗,所以有多必要准备几只移液管,建议:10ml/2支,5ml/2支,1ml/5支。
    2.培养基的配制:
    经典的组织培养用培养基是ms配方,其基本上划分为:大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、植物激素、糖和支持物。这些成分的用量都在毫克级,用普通天平是难以称量的,为了解决这个问题,我们可以按比例放大各成分的用量配制成母液,使用的时候按一定比例加入即可。
    下面我将一种ms培养基的母液配制方案公布如下:
    大量元素:硝酸铵66.0克;
    硝酸钾76.0克;
    无水氯化钙13.3克;
    七水硫酸镁14.8克;
    磷酸二氢钾6.8克。
    以上分别溶解后合并定容到1升,每配制1升标准ms培养基取25毫升。
    铁盐:七水硫酸亚铁5.56克;
    乙二胺四乙酸二钠(edtana)7.46克。
    以上两种分别加热溶解,混合,定容到1升,调整ph到5.5以下,每配制一升ms取5毫升。
    微量元素和有机复合物的用量过于微小,为了简便我们可以用蔬菜提取液或者马铃薯提取液代替。通常我们习惯用100克菠菜加100ml的水煮沸10分钟,过滤留滤液,每配制1升ms培养基加入20~50毫升提取液。同样也可以使用带皮马铃薯100克加200毫升水煮沸15分钟,过滤留滤液,每升ms加入50~100毫升即可。
    加入上述各组分后,每升ms培养基还需要加入白砂糖30克,琼脂7克。这里要说明的是,糖和琼脂都是可变的量,要根据需要调整。另外制作果冻用的卡拉胶也可以代替琼脂,透明度更好。
    上述各成分加入后,定容到800毫升左右,用微波炉加热,直到琼脂全部溶解为止。此时加入所需的植物激素(通常配制成0.1%溶液,这样每取1毫升,换算到培养基中就是1ppm)。然后加水定容到1100毫升(1.1升),之所以多出0.1升是为了抵消分装和消毒中的损耗。最后用酸碱调整ph到5.8~6.0。
  3.使用ms原粉配制培养基:
    目前国内的一些化学品公司开发了简便的ms培养基原粉,大大简便了培养基的配制,根据不同公司的说明选择培养基的种类。下面就以泛生化学品公司的ms原粉为例:泛生化学品公司生产的ms培养基原粉,包括了大量元素、微量元素、铁盐、有机复合物、糖和支持物,他们的支持物是一种人工合成的半乳糖硫酸脂——polygal,这种物质作为支持物虽然提高了成本,但是无论是透明度还是强度都优于琼脂,更重要的是ploygal对组织的褐变有一定的抑制作用,对初学者尤为重要。一般称取ms原粉40克,加水800毫升,微波炉加热溶解,加入激素,定容到1100毫升(1.1升),调整ph值到5.8~6.0。
    值得指出的是polygal还有一个特点,他对ph和灭菌时间的敏感性很强,如果培养基配制和灭菌出现问题,他会变色来提醒实验者培养基出现问题,这个也对初学者有一定的帮助。泛生公司也提供纯品polygal供研究使用。
    泛生公司的ms原粉价格大约是50元1000克,能制备20升ms培养基。这对于家庭做组培的爱好者来说,花50元钱可以使用一两年。
    4.分装:
    将配制好的培养基分装在培养容器中,注意要趁热分装,因为琼脂在40度以下就会凝固。每个培养瓶装培养基大约是瓶容积的1/6~1/5,注意不要将培养基挂在瓶的外壁,这样容易造成污染。分装后用聚丙烯薄膜或着方便面的袋子封口,用胶圈固定(胶圈尽量选择自行车的内胎,这种胶圈比较耐热)。
    5.灭菌:
    采用家庭压力锅消毒,建议到医疗器械用品商店买一些“灭菌效果试纸”,它们可以指示灭菌效果,当灭菌达到效果时会变色。把试纸和培养基同时放入锅内,加热到有大量蒸汽冒出,再加上压力伐,维持小火30~40分钟。
    灭菌完毕后自然冷却,将培养基取出,放在阴凉无尘处备用。
    6.接种箱的准备:
    新作的接种箱必须要清洁干净,尽量做到无死角。每次使用前2小时,将操作所需要的全部物品放入接种箱,再用一个小烧杯加入3~5克高锰酸钾放入接种箱内,在箱内向烧杯中倒入2~3毫升的甲醛溶液,大约几秒钟后会看到甲醛蒸汽出现,这样可以对接种箱内的所有物品进行初次消毒;同时打开紫外线灯照射。紫外线灯是高电压穿激汞蒸汽产生的,紫外线进行第二道灭菌,在紫外线照射大约15分钟后,会激发氧气形成臭氧,臭氧作为第三道灭菌防线,这样经过三次灭菌,接种箱基本上可以达到无菌标准。
    在操作前15分钟内,向刚才蒸发甲醛用的烧杯中倒入5毫升浓氨水,因为甲醛对人体有毒害作用,氨水可以和甲醛形成一种叫做“六亚甲基四胺”的固体物质,从而中和了甲醛的刺激性蒸汽。这个时候紫外灯不要关掉,要继续照射,直到操作前5分钟关闭,维持黑暗5分钟,然后再打开日光灯进行操作。维持5分钟黑暗的原因是,紫外光对微生物的杀灭是作用于dna的胸腺嘧啶,形成四聚体,但是微生物具有一种光复活蛋白,可以在有可见光的环境下还原胸腺四聚体,而使微生物复活,这个作用叫做“光复活作用”,所以在关掉紫外灯后必须维持黑暗几分钟,避免光复活作用的出现。

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