2022-03-23
中国樱桃泰山干樱Ｓ－ＲＮａｓｅ基因的克隆及序列分析
繁殖方法2022-03-23 08:29:02
摘要：以中国樱桃品种泰山干樱为试材，利用李属植物C2、C5保守区引物，扩增花柱，S-RNase基因，获得4个S等位基因，测序结果表明序列大小分别为：1608、950、796、504bp。根据同源比较发现大小为796 bp的等位基因与基因库中登录的SI—RNase为同一基因，其它3个S-RNase基因为首次报道，依序列大小分别命名为S2(1608 bp，登陆号EF541168)、S4(950bp，登陆号EF541173)和S6(504 bp，登陆号EF541172)。序列分析表明S2-RNase在C3区存在终止密码子，导致翻译提早终止；S4-RNase的C5区前有插入片断；S6-RNclse在高变区比其它S等位基因少一个氨基酸残基。氨基酸序列同源性比较分析表明，中国樱桃S—RNase与樱花、扁桃的相似性高。在系统进化树中中国樱桃的4个S-RNase基因的氨基酸序列和樱花、扁桃、甜樱桃、酸樱桃等一起归于李亚科。
中图分类号：S662.5 文献标识码：A
文章编号：1009-9980(2008)03-332-06
蔷薇科的多数果树，如苹果、梨、甜樱桃等的绝大多数品种均表现为典型的配子体自交不亲和性，这对于以收获果实为目的的果树来说，自花不结实或结实率低无疑是不利的，生产上常因授粉树配置不当、人工授粉不及时或花期遭遇不良气候而影响昆虫传粉造成减产。因此阐明果树自交亲和与不亲和的分子机制、筛选和培育自交亲和品种成为国内外科学家的重要研究目标。
在蔷薇科果树中。李属植物因其S位点区域的物理距离小而成为GSI研究的模式植物，樱桃更以其天然存在自交亲和与不亲和、二倍体与多倍体的完整系统而成为研究李属植物自交亲和与不亲和性作用机制及关系演变的理想材料。目前，世界上普遍栽培的樱桃有4个种，其中欧洲甜樱桃以其味美、外形美观等特点深受消费者喜爱，是经济栽培的主要对象。因其表现为自交不亲和成为自交不亲和研究的重要材料，国内外有关其基因型鉴定、花柱S-RNase基因克隆表达及遗传特性、花粉SFB(S locus F-box)基因的克隆表达等研究均有报道；而同为栽培种的中国樱桃，作为我国特有的果树种质资源，与欧洲甜樱桃在自交亲和性及不亲和性上表现截然不同，为四倍体植株，表现自交亲和性，但是在国际范围内，尚未见有关其自交亲和性分子基础的研究报道。因此，我们以中国樱桃品种泰山干樱为试材，开展花柱S-RNase基因的克隆和序列分析，研究结果对于深入了解其自交亲和遗传信息，进一步探讨自交亲和的分子机理具有重要意义，同时也将为实现甜樱桃的自交亲和性品种选育提供参考。
1、材料和方法
1．1、材料
供试中国樱桃品种泰山干樱来自山东省果树研究所，春季选取幼嫩叶片，于液氮中速冻，置20℃冰箱贮藏备用。
1．2、基因组DNA提取
基因组DNA提取采用改良CTAB法。
1．3、引物设计
采用已发表的樱桃S-RNase基因的C2区和C5区设计的通用引物Pru-C2/Pru-C5。由上海博亚生物技术有限公司合成，序列分别为：Pru-C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru-C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。
1．4、PCR扩增及检测
引物Pru-C2/Pru-C5 PCR反应体系为25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl22 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反应条件为：94℃预变性3 min；33个循环的94℃变性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min：最后72℃延伸10 min。
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统观察并拍照。
1．5、S基因扩增片段的克隆、测序
将扩增产物连接到PMD-19载体中，转入感受态DH5α大肠杆菌中进行克隆。蓝白斑筛选挑取阳性克隆，对菌液进行PCR检测，用1.5％的琼脂糖电泳检测产物，确定插入片断为目的片段，提取质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。
1．6、序列比较和系统树的构建
利用软件DNAMAN对克隆的序列进行同源性比较；并利用Mega3.1对25个蔷薇科、茄科、玄参科的S-RNase序列做多重比较，以邻位相连法(neigh-bor-joining method)构建系统进化树。
1．7 、自交亲和性的授粉试验
于开花前1d或当天采集花蕾，取出花药。待其自然开裂，花粉散出后，收集花粉备用。对当天即将开花的花蕾在散粉前去雄，同时疏去一些生长较弱的花蕾，进行授粉套袋，每组合250朵花。授粉后72 h，随机选取10朵花，从花柱基部切取花柱，用FAA固定，利用荧光显微镜观察花粉原位萌发及花粉管生长情况，方法参照Kho等，并进行显微拍摄，每个处理重复10根花柱。套袋后1周去袋，1个月后统计坐果率。
2、结果与分析
2．1、泰山干樱S-RNase基因的特异PCR扩增
用Pru-C2/Pru-C5引物对泰山干樱的基因组DNA进行PCR扩增，图谱中可扩增出4条特异片断，这与中国樱桃为四倍体植株是相符合的，即存在4个S等位基因。扩增片断大小范围在1 700~600 bp，为了便于对这4个目的条带进行进一步的分析研究，我们将其分别命名为A、B、C、D。
2．2、泰山干樱S-RNase基因的同源性比较
为进一步分析扩增产物的序列特征，对目的片断回收、克隆并测序。测序结果表明，特异片断A、B、C、D的大小分别为：1 658、1 001、846、565 bp。将序列结果在NCBI上同源比较，发现4个基因与李属植物樱花、扁桃、甜樱桃的S-RNases同源性在77.25％～98.31％(表1)，具有较高的同源性，可确定扩增片断均为S-RNases的等位基因。其中片断C与吴燕等在中国樱桃平都长把红中得到并登陆的S1-RNase同源性100％，2者应为同一S等位基因。在本试验中由于设计引物位置的变化，扩增片断长出117 bp，因此我们将片段C命名为S1，为了进一步增加S基因的遗传信息，该序列信息也登录在基因库，登录号为：EF541170。而A、B、D 3个扩增片断均为首次发现的S等位基因，依片断大小分别命名为S2 RNase、S4-RNase、S6-RNase(S3，S5为本实验室登陆的其它品种的S-RNase基因)，在[2]原版全文
中图分类号：S662.5 文献标识码：A
文章编号：1009-9980(2008)03-332-06
蔷薇科的多数果树，如苹果、梨、甜樱桃等的绝大多数品种均表现为典型的配子体自交不亲和性，这对于以收获果实为目的的果树来说，自花不结实或结实率低无疑是不利的，生产上常因授粉树配置不当、人工授粉不及时或花期遭遇不良气候而影响昆虫传粉造成减产。因此阐明果树自交亲和与不亲和的分子机制、筛选和培育自交亲和品种成为国内外科学家的重要研究目标。
在蔷薇科果树中。李属植物因其S位点区域的物理距离小而成为GSI研究的模式植物，樱桃更以其天然存在自交亲和与不亲和、二倍体与多倍体的完整系统而成为研究李属植物自交亲和与不亲和性作用机制及关系演变的理想材料。目前，世界上普遍栽培的樱桃有4个种，其中欧洲甜樱桃以其味美、外形美观等特点深受消费者喜爱，是经济栽培的主要对象。因其表现为自交不亲和成为自交不亲和研究的重要材料，国内外有关其基因型鉴定、花柱S-RNase基因克隆表达及遗传特性、花粉SFB(S locus F-box)基因的克隆表达等研究均有报道；而同为栽培种的中国樱桃，作为我国特有的果树种质资源，与欧洲甜樱桃在自交亲和性及不亲和性上表现截然不同，为四倍体植株，表现自交亲和性，但是在国际范围内，尚未见有关其自交亲和性分子基础的研究报道。因此，我们以中国樱桃品种泰山干樱为试材，开展花柱S-RNase基因的克隆和序列分析，研究结果对于深入了解其自交亲和遗传信息，进一步探讨自交亲和的分子机理具有重要意义，同时也将为实现甜樱桃的自交亲和性品种选育提供参考。
1、材料和方法
1．1、材料
供试中国樱桃品种泰山干樱来自山东省果树研究所，春季选取幼嫩叶片，于液氮中速冻，置20℃冰箱贮藏备用。
1．2、基因组DNA提取
基因组DNA提取采用改良CTAB法。
1．3、引物设计
采用已发表的樱桃S-RNase基因的C2区和C5区设计的通用引物Pru-C2/Pru-C5。由上海博亚生物技术有限公司合成，序列分别为：Pru-C2：5’CTATGGCCAAGTAATFATrCAAACC 3’，Pru-C5：5’CAAAATACCACTFCATGTAACAAC 3’。
1．4、PCR扩增及检测
引物Pru-C2/Pru-C5 PCR反应体系为25 μL，包含10×PCRBuffer，MgCl22 mmol/L，dNTP 0.2 mmol/L，引物各0.15 μmol/L，Taq酶1 U，模板50 ng。反应条件为：94℃预变性3 min；33个循环的94℃变性60 s，56℃退火45 s，72℃延伸1.5 min：最后72℃延伸10 min。
PCR产物用1.0％琼脂糖凝胶电泳进行检测，凝胶成像系统观察并拍照。
1．5、S基因扩增片段的克隆、测序
将扩增产物连接到PMD-19载体中，转入感受态DH5α大肠杆菌中进行克隆。蓝白斑筛选挑取阳性克隆，对菌液进行PCR检测，用1.5％的琼脂糖电泳检测产物，确定插入片断为目的片段，提取质粒送上海博亚生物技术有限公司测序。
1．6、序列比较和系统树的构建
利用软件DNAMAN对克隆的序列进行同源性比较；并利用Mega3.1对25个蔷薇科、茄科、玄参科的S-RNase序列做多重比较，以邻位相连法(neigh-bor-joining method)构建系统进化树。
1．7 、自交亲和性的授粉试验
于开花前1d或当天采集花蕾，取出花药。待其自然开裂，花粉散出后，收集花粉备用。对当天即将开花的花蕾在散粉前去雄，同时疏去一些生长较弱的花蕾，进行授粉套袋，每组合250朵花。授粉后72 h，随机选取10朵花，从花柱基部切取花柱，用FAA固定，利用荧光显微镜观察花粉原位萌发及花粉管生长情况，方法参照Kho等，并进行显微拍摄，每个处理重复10根花柱。套袋后1周去袋，1个月后统计坐果率。
2、结果与分析
2．1、泰山干樱S-RNase基因的特异PCR扩增
用Pru-C2/Pru-C5引物对泰山干樱的基因组DNA进行PCR扩增，图谱中可扩增出4条特异片断，这与中国樱桃为四倍体植株是相符合的，即存在4个S等位基因。扩增片断大小范围在1 700~600 bp，为了便于对这4个目的条带进行进一步的分析研究，我们将其分别命名为A、B、C、D。
2．2、泰山干樱S-RNase基因的同源性比较
为进一步分析扩增产物的序列特征，对目的片断回收、克隆并测序。测序结果表明，特异片断A、B、C、D的大小分别为：1 658、1 001、846、565 bp。将序列结果在NCBI上同源比较，发现4个基因与李属植物樱花、扁桃、甜樱桃的S-RNases同源性在77.25％～98.31％(表1)，具有较高的同源性，可确定扩增片断均为S-RNases的等位基因。其中片断C与吴燕等在中国樱桃平都长把红中得到并登陆的S1-RNase同源性100％，2者应为同一S等位基因。在本试验中由于设计引物位置的变化，扩增片断长出117 bp，因此我们将片段C命名为S1，为了进一步增加S基因的遗传信息，该序列信息也登录在基因库，登录号为：EF541170。而A、B、D 3个扩增片断均为首次发现的S等位基因，依片断大小分别命名为S2 RNase、S4-RNase、S6-RNase(S3，S5为本实验室登陆的其它品种的S-RNase基因)，在[2]原版全文